Определение HLA-фенотипа

На мембране клеток организма присутствуют продукты генов всех локусов, размещенных на обеих нитях 6-й хромосомы. Это означает, что HLA-гены наследуются по кодоминантному типу, т. е. одну хромосому ребенок наследует от матери, а другую – от отца. Как уже упоминалось, совокупность генов, расположенных на одной хромосоме, составляет гаплотип. Таким образом, у человека два гаплотипа и каждая клетка организма несет на себе диплоидный набор антигенов системы HLA, один из которых кодируется HLA-генами матери, а другой – отца. Исключение составляют половые клетки (яйцеклетка и сперматозоид), каждая из которых содержит в своем ядре только по одному гаплотипу.

Антигены гистосовместимости, выявляемые на клетках конкретного человека, составляют HLA-фенотип. Для его определения необходимо произвести фенотипирование клеток индивида. Как правило, “типируются” лимфоциты периферической крови. В данном случае не известно, какие именно HLA-антигены каким из двух гаплотипов родителей кодируются. Чтобы это определить, необходимо произвести типирование родителей, после чего можно установить гаплотипы обследуемого и, соответственно, его генотип – последовательность расположения генов на хромосоме. На практике HLA-фенотип записывают, соблюдая числовой порядок HLA-антигенов, согласно номенклатуре. Например:HLA-фенотип субъекта— Al,2; B5,12; DR2,5; DQ3,4.

В данном случае можно предположить 100 вариантов гаплотипов родителей, 50 из которых принадлежат матери, а 50 – отцу. Определить их, как уже указывалось, можно только посред-ством типирования.

Если в результате типирования определяется только один антиген по какому-либо локусу, то это является следствием гомозиготности индивида по данному гену. Следовательно, от отца и матери унаследована аллель одинаковой специфичности.

До настоящего времени в большинстве лабораторий HLA-A. В, С и DR-антигены определяют при помощи серологических методов, в частности, лимфоцитотоксического теста. Этот тест основан на способности анти-НLА-антител в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты. Гибель клеток демонстрируется при помощи добавления трипанового синего. При этом мертвые поврежденные клетки окрашиваются, и под микроскопом учитывается их количество. Применяется также микрометод, являющийся модификацией лимфо-цитотоксического теста. Для его постановки используют всего лишь 1 мкл типирующих сывороток, а также небольшое количество клеток. Микролимфоцитотоксический тест является стандартным и используется во всех типирующих лабораториях мира. Набор типирующих сывороток (типирую-щая панель) создается в результате кропотливых исследований из образцов сывороток, содержащих анти-НLА-антитела. Эти антитела могут индуцироваться во время беременности, при гемотрансфу-зиях, а также в результате пересадки аллотрансплантатов. Основными продуцентами типирующих сывороток являются многорожавшие женщины, которые иммунизируются HLA-продуктами мужа во время вынашивания плода.

Представления о строении системы HLA развивались и развиваются в течение всего периода ее изучения, однако за последние годы произошел качественный скачок в развитии этой проблемы. Ранее, когда основным объектом исследования служили только антигены системы HLA, представления о комплексе генов HLA могли формироваться в основном на анализе косвенных данных, включающих изучение антигенов системы HLA в популяциях, семейном анализе, ре-акциях, субстратом которых были HLА-антигены. Теперь, благодаря развитию молекулярной генетики и иммунохимии, появилась возможность не только проводить тонкий анализ HLA-антигенов, но и изучить сами гены HLA. Особый прогресс в этом направлении был достигнут после открытия и внедрения в исследования в области изучения системы HLA .метода полиме-разной цепной реакции (ПЦР), позволяющего анализировать необходимые для исследований участки ДНК, что, в свою очередь, открыло широкие возможности для быстрого и точного анализа молекулярного полиморфизма HLA.

Реакция амплификации ДИК in vitro основана на способности молекул нуклеотидтрифосфа-тов в присутствии ДНК-полимеразы при соответствующих условиях (рН, ионная сила раствора, температура) образовывать на матрице (одноцепочечной ДНК) комплементарную цепь. Необходимым условием синтеза является наличие праймера–олигонуклеотида, который синтезируется искусственно.

Для повышения точности реакции и увеличения чувствительности, как правило, используют пару праймеров. Управление ходом реакции идет с помощью изменения температурных усло-вий. При определенной температуре (зависит от нуклеотидного состава ДНК) идет расхождение двойной цепи ДНК – плавление. Снижение температуры приводит к обратному процессу – соединению комплементарных цепей – отжигу. При избытке праймеров в растворе вероятность отжига на ДНК-матрице праймера гораздо выше, чем присоединение полной цепи. И, поскольку праймер меньше матрицы, начинается активное достраивание (синтез) комплементарной цепи. Скорость достройки достигает нескольких сотен (иногда более тысячи) нуклеотидов в секунду. Таким образом, в конце цикла имеется удвоенный набор ДНК (точнее не всей ДНК, а участка, ограниченного праймерами). Снова повышается температура – плавление – отжиг – синтез – и в растворе уже 4 копии исходной матрицы. Количество копий (амплификатов) растет в геометрической прогрессии, и после 30—40 циклов в растворе находится от 10 млн. до 10 млрд. копий исходной матрицы. Причем, поскольку имеется пара праймеров. амплификаты будут строго определенного размера. Такое количество ДНК можно визуально обнаружить, например, при электрофорезе на агарозном геле с бромидом этидия.

Существует несколько методик проведения полимеразной цепной реакции.

SSO(sequence specific oligonucleotide)–неспецифическая амплификация исследуемого участка (локуса) ДНК с последующей специфической гибридизацией с мечеными.ДНК-зондами.

RFLP(restriction fragment length polymorphism) – неспецифическая амплификация с последующим переваром продуктов амплификации набором рестриктаз. По длине полученных продуктов судят о нуклеотидном составе.

SSCP(single-strand conformation polymorphism)–различие аллелей по электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК, обусловленной характерными элементами вторичной структуры.

SSP(sequence specific primer) – наиболее распространенная и технически простая методика, когда каждому аллельному варианту либо группе аллелей соответствует своя пара праймеров. Разработана новая модификация этой методики – MSSP (mixture of sequence specific primer) – позволяющая за счет более рационального выбора праймеров и режимов амплификации выявить сразу несколько специфичностей, используя одну пробирку и одну дорожку на геле. Длительность определения – около 2,5—3 ч.

Как было сказано выше, для выявления классических антигенов системы HLA локусов А,В,С и DR используется серологическая реакция микролимфоцитотоксичности, в которой применяются специальные антисыворотки, содержащие антитела к указанным антигенам. Молекулярное же типирование позволяет с помощью метода ПЦР выявлять различные аллели HLA на уровне ДНК. Это дает возможность выявлять те аллели генов HLA класса II, которые трудно выявляются с помощью серологического типирования, либо вовсе не выявляются. Так, например, с помощью серологической техники в локусе DR выявлено 14 антигенов, а с помощью ДНК-типирования – более 100 аллелей.

Установление новых, реально функционирующих аллелей заставило пересмотреть ранее существовавшую номенклатуру HLA, и теперь принято четырехзначное обозначение (например А0101 вместо А1). В тех же случаях, когда установлено несколько аллелей, которые по прежним представлениям кодировали различные субтипы одного антигена (например, в HLA-A2 сегодня установлено 47 таких субтипов), то теперь их обозначают как различные аллели, имеющие общие первые цифры. Например, от HLA0201 до HLA0267 или от HLAB2701 до HLAB2725.

Вышесказанное прямо относится только к классу I HLA, где полиморфной является только одна цепь. В классе II из-за возможного полиморфизма как бета, так и альфа генов, установленные аллели обоз1начают в зависимости от цепи, несущей вариабельный участок ДНК, определяющий специфичности, например DQA1-0501 и DQB1-0501.В настоящее время селекция донора и реципиента по HLA-антигенам с использованием ДНК-типирования стала рутинным методом в типирующих лабораториях трансплантационных центров. Данные последних лет показывают, что выживаемость трупного почечного аллотран-сплантата в течение 1 года при подборе пары донор-реципиент с помощью ДНК-типирования составила 90%. В то же время при подборе пары с помощью серологического типирования эта же цифра оказалась равной 68%.

Не менее важным является определение HLA-фенотипа с помощью ДНК-типирования при решении вопроса о спорном отцовстве. В этом довольно ответственном и деликатном вопросе использование ПЦР также повышает точность анализа.

Наконец, немаловажным является практическое применение ПЦР для идентификации ДНК микроорганизмов при проведении диагностики инфекционной патологии. Опыт, накопленный за последнее время, показывает огромные перспективы использования ПЦР в этой области.

С учетом того, что серологическое типирование продолжает оставаться в арсенале методов, используемых для определения HLA-фенотипа, в мире ведется большая и непрерывная работа по сопоставлению соответствия HLA-аллелей, выявленных с помощью ДНК-типирования, антигенам HLA-локусов, выявленных с помощью серологического типирования. В журнале International J.of Immunogenetics (2005, v.32, №1) опубликованы последние данные по такому сопоставлению: The HLA Dictionary 2004: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5 and –DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B,-C, -DR and –DQ antigens (G.M.Th. Schreuder и соавт.).