Біологічні системи різного рівня організації і наночастинки золота

Унікальні фізико-хімічні, біологічні, біохімічні, фармакологічні властивості, такі як інертність, стабільність, біосумісність, вплив на органи організму, низький рівень цитотоксичності та інше, обумовлюють значний інтерес фахівців різних спеціальностей до металів нанорозмірів, у тому числі наночастинок золота і визначають перспективність широкого їх застосування: у якості векторів для цільової доставки протипухлинних, протизапальних та протимікробних засобів, для створення біосенсорів, а також у якості контрастних агентів, ефективніших за стандартні препарати на основі йодпохідних сполук [36, 43, 45, 48, 53, 54, 64, 66].

Методи отримання та характеристика наночастинок золота різного розміру.

Усі відомі на сьогоднішній день методи синтезу наночастинок золота можна умовно поділити на дві групи: дисперсійні та конденсаційні [11]. Дисперсійі методи засновані на руйнуванні кристалічної решітки металевого золота під дією електричного струму високої напруги. Під впливом електричного струму в рідині між двома золотими електродами утворюється електрична дуга. Під час її "горіння" відбувається перенесення речовини між електродами, яке супроводжується утворенням наночастинок золота. На вихід та форму частинок, що утворюються під дією електричного струму, окрім напруги між електродами та сили струму, впливає також наявність у розчині електролітів. При використанні постійного струму утворюються неоднорідні за розміром частинки золота. Додавання навіть незначних кількостей лугів або хлоридів і застосування для розпилення змінного струму високої частоти суттєво покращують якість наночастинок золота, однак, розподіл частинок за розміром частіш за все залишається достатньо широким [11, 30].

Більш поширеними, порівняно з дисперсійними, є конденсаційні методи. Їх розділяють на фізичні та хімічні. Формування наночастинок цими методами здійснюється через низку проміжних станів, які призводять до виникнення зародків нової фази, спонтанного їх росту та утворення фізичної поверхні розділу фаз. При цьому важливим є контроль швидкостей утворення зародків нової фази та їх росту [11, 30, 71].

Найбільш часто за допомогою конденсаційних методів наночастинки золота отримують відновленням галогенідів золота (наприклад, HAuCl₄) із використанням хімічних відновлювачів, ультразвукового, ультрафіолетового опромінення, імпульсного або лазерного радіолізу [11, 30, 83]. У якості хімічних відновлювачів використовують алюмо- та борогідриди, тетраборати, цитрат натрію, формальдегід, ацетон, етиловий спирт, пероксид водню та інші органічні і неорганічні сполуки [11, 44, 67, 70, 82, 83].

Методи хімічної конденсації дозволяють отримувати достатньо стійкі до агрегації наночастинки золота. Так, золь золота червоного кольору із розміром частинок 20 нм, отриманий у 1857 році М.Фарадеєм, зберігся до теперішнього часу. Стійкість до агрегації наночастинок золота пояснюється утворенням подвійного електричного шару на поверхні тверде тіло - розчин та виникненням електро-статичної складової розклинюючого тиску, що є основним фактором стабілізації цієї системи [11, 30]. Використання одного з зазначених методів дозволяє отримати відповідний тип наночастинок золота із заданими фізико-хімічними характеристиками.Серед усього різноманіття методів синтезу сферичних наночастинок золота методи хімічної конденсації є найбільш доцільними в умовах забезпечення потреб біології та медицини. Це обумовлено, перш за все, середовищем перебігу реакції синтезу, яким є водний розчин. Можливість отримання водних дисперсій наночастинок золота забезпечує більш виражену спорідненість синтезованих наноматеріалів до біологічних клітин.Метод трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ), використаний для отримання електронно-мікроскопічних зображень наночастинок золота, входить у перелік обов'язкових методів, рекомендованих для оцінки фізико-хімічних властивостей наноматеріалів за міжнародними стандартами [55].

Методи хімічної конденсації базуються на переході розчиненого золота (водний розчин золотохлористоводневої кислоти) в нерозчинний стан з подальшою агрегацією та кристалізацією нерозчинних частинок, які утворюють дисперсну фазу. Зазвичай, структура наночастинок є досить складною і залежить від умов синтезу та природи використаного стабілізатора [40].

Іони AuO -, що міцно абсорбовані на поверхні наночастинок, є потенціало-утворюючими та обумовлюють їх негативний заряд, який у фізіологічних умовах складає декілька десятків мілівольт [19, 33].Особливості будови наночастинок золота відіграють значну роль в умовах їх контакту з біологічними системами різного рівня організації. Так, золото, як метал, зазвичай інертне, але наночастинки золота володіють високою реакційною здатністю та можуть слугувати каталізатором для багатьох біохімічних реакцій [36]. Це обумовлено тим, що залежно від розміру наночастинок різна кількість їх атомів-складових знаходиться на поверхні: чим менший розмір частинок тим більший відсоток поверхневих атомів. Внаслідок збільшення площі активної поверхні на одиницю маси, зміни міжатомарної відстані та періоду кристалічної решітки змінюється здатність наночастинок проникати в клітину, їх біологічна активність, а також хімічні, фізичні, фізико-хімічні, та фармакологічні властивості [20, 36].

Характеристика стабільності препаратів наночастинок золота.

Важливою характеристикою нананоматеріалів, призначених для медико-біологічного застосування, є їх стабільність при контакті з біологічним середовищем. Основним параметром стабільності наночастинок при контакті з біологічними системами різного рівня організації є їх стійкість до коагуляції. Як моделі можуть використовуватись фізіологічний розчин та комерційні препарати плазмоза-мінників, застосування яких поширене в медичній практиці і може вважатися моделлю крові.Відомо, що наночастинки золота здатні інтенсивно поглинати світло у видимій області спектру з максимумом поглинання в діапазоні 520 - 550 нм. При цьому положення, форма та інтенсивність піку абсорбції знаходяться у прямій залежності від розміру та концентрації наночастинок. Ці властивості наночастинок золота дозволяють з високою точністю оцінювати їх стабільність в умовах моделювання контакту з біологічним оточенням [15].

Рівень коагуляції наночастинок золота визначається за зміною положення, інтенсивності та форми піку абсорбції у області спектру 500-560 нм. Так, на рис. 3, на прикладі водної дисперсії наночастинок золота розміром 30 нм, наведені типові дані, які характеризують стабільність препаратів наночастинок у присутності модельних систем крові. Кінцева концентрація модельних систем крові, в якості яких були використані фізіологічний розчин (0,9% NaCl), комерційний плазмозамінник "Стабізол" та комерційний плазмозамінник "Реополіглюкін", при інкубації з наночастинками золота розміром 30 нм становила 10%, 20% та 30%.Підвищення рівня коагуляції при використанні в якості модельної системи фізіологічного розчину може бути обумовлено впливом одновалентних катіонів Na⁺ на заряд наночастинок. Наночастинки золота, для яких наведені експериментальні дані, характеризуються незначним негативним зарядом, тому одновалентні катіони здатні знижувати електрокінетичний потенціал наночастинок, що призводить до їх коагуляції.

Особливості взаємодії наночастинок золота різного розміру з білками.

Наночастинки золота, так само як і наночастинки інших металів, володіють значним потенціалом регулювання внутрішньоклітинних процесів, зокрема на рівні взаємодії білок-білок, білок-нуклеїнова кислота та регуляції ферментативної активності. Логічно припустити, що механізми такої взаємодії у фізіологічних умовах (рН 7,4-7,6) будуть визначатись, з одного боку, особливостями структури та сумарним зарядом молекул білків, а з іншого - природою, структурним складом та розміром наночастинок. Отже, молекули білків, залежно від їх фізико-хімічних властивостей, можуть певним чином взаємодіяти з наночастинками золота, модифікувати їх поверхню і як наслідок, сприяти агрегації або стабілізації наночастинок.Так, при дослідженні особливостей взаємодії трьох білків (сироваткового альбуміну людини (САЛ), трипсину та лізоциму) з наночастинками золота середнього розміру 20 і 30 нм виявлений ряд закономірностей, пов'язаний, перш за все, із значенням ізоелектричної точки білків та розміром наночастинок. Експериментально встановлено, що сироватковий альбумін людини не виявляє здатності до взаємодії з наночастинками золота розміром 20 нм. Виявлені особливості обумовлені тим, що в умовах експерименту (рН 7,4-7,6) білкова молекула САЛ несе сумарний негативний заряд (її ізоелектрична точка складає 4,5-4,9), як і наночастинки золота. Проте при взаємодії цього білку з наночастинками золота розміром 30 нм спостерігається процес флокуляції у діапазоні концентрацій білка 10-70 мкг/мл, рівень якої не перевищує 40 %, ймовірно обумовлений розмірним ефектом наночастинок золота.

При взаємодії з трипсином при тих же умовах експерименту в концентраційному діапазоні 1-100 мкг/мл має місце флокуляція досліджених наночастинок золота обох розмірів. У цьому випадку визначальним фактором взаємодії є сумарний позитивний заряд білкової молекули.Взаємодія лізоциму з наночастинками золота характеризується особливими властивостями. Так, флокуляція наночастинок золота розміром 20 нм спостерігається в інтервалі концентрацій білку 1-10 мкг/мл. Подальше підвищення вмісту білку до 30 мкг/мл призводить до стабілізації системи білок-наночастинка.

При взаємодії лізоциму з наночастинками золота розміром 30 нм виявлені три концентраційні діапазони білку, які визначають агрегативну стійкість системи. Так, при концентраціях лізоциму в діапазонах 1-50 мкг/мл та 70-100 мкг/ мл спостерігається активна флокуляція, а при концентраціях 50-70 мкг/мл - стабілізація наночастинок золота розміром 30 нм [40, 68].

Таким чином, визначальними факторами взаємодії білкових молекул з наночастинками золота є їх структура та фізико-хімічні властивості в заданих конкретних умовах середовища контакту.

Особливості взаємодії наночастинок золота з бактеріальними клтинами.

Бактеріальні клітини, завдяки унікальним структурним властивостям та обміну речовин здатні активно контактувати з мінеральними компонентами оточуючого середовища, до яких відносяться і наночастинки металів, зокрема золота. З іншого боку, бактерії суттєво, часто різноспрямовано, впливають на організм людини і тварин [1, 14, 16].

Дослідження впливу наночастинок золота на функціональний стан бактеріальних клітин свідчать про можливість контролювання та управління інтенсивністю їх фізіолого-біохімічних реакцій [6, 63]. Виявлена здатність деяких інтактних мікроорганізмів селективно концентрувати наночастинки золота середнього розміру 15-20 нм [13, 18, 19]. Інактивація мікроорганізмів, що володіють цими властивостями, призводить до значного зниження або навіть цілковитої втрати цієї особливості.Механізми і процеси стадії селективної взаємодії інтактної бактеріальної клітини з наночастинкою розвиваються на основі фізико-хімічної моделі подвійного електричного шару живої клітини, яка встановлює взаємозв'язок між поверхневим зарядом клітини і відповідною величиною трансмембранного потенціалу [40]. Модель такого біоспецифічного подвійного шару побудована на розгляді двох його головних параметрів: рівноважного електричного потенціалу\и , який виникає у результаті дисоціації функціональних груп на поверхні клітини, і не-рівноважного потенціалу , який виникає внаслідок активного транспорту протонів. Використання такого підходу дозволило знайти шляхи регулювання спрямованості і ефективності гетерокоагуляції клітини і частинки в залежності від природи, заряду, розміру частинки і фізіологічного стану клітини [31].

Біохімічно важливими факторами, що відповідають за процес акумулюван-ня клітиною наночастинок золота розміром 15-20 нм на її поверхні, є генерація трансмембранного потенціалу як результат функціонування дихального ланцюга та мембранної АТР-ази. Так, накопичення металу підсилюється при введенні в систему енергетичного субстрату АТР і переходить у зворотній процес вивільнення наночастинок золота в розчин при додаванні дициклогексилкарбодііміду (ДЦКД) - високоспецифічного інгібітора АТР-ази. Зі збільшенням часу контакту наночастинок золота і клітини фізична адгезія наночастинок золота на поверхні клітин переходить у хімічну взаємодію за участі функціональних груп на поверхні клітинної мембрани, зокрема карбоксильних СООН та тіолових SH [34, 78, 79].

У клітинних оболонках золотофільних бактерій Bacillus sp. виявлені високополімерні структури глікопротеїнової природи (молекулярна маса 50 кДа), які активно зв'язують наночастинки золота завдяки наявності в їх структурі позитивно заряджених аміногруп NH₂⁺ [32]. Такі структурні компоненти виступають як своєрідні клітинні рецептори, що сприяють процесу специфічної взаємодії клітини з наночастинками золота.При порівнянні структур глікопротеїнової природи, виділених з клітинних оболонок активних та неактивних штамів бактерій, встановлено, що незважаючи на близькі характеристики молекулярної маси, ці глікопротеїди характеризуються різним значенням рН їх ізоелектричної точки (рІ) [13, 18, 19]. Глікопротеїди активних та неактивних штамів бактерій мають значення ізоелектричних точок рІ 11 та рІ 5 відповідно. Наявність такого роду структур обумовлює мозаїчність заряду поверхні бактеріальних клітин із появою специфічних ділянок на їх поверхні, активних відносно взаємодії з наночастинками золота. Відмін-ність значень ізоелектричної точки глікопротеїдів активних та неактивних штамів може бути обумовлена стеричними факторами та конформаційними змінами макромолекули глікопротеїду та свідчити про причетність цієї молекулярної структури до транспорту наночастинок золота, ймовірно обумовленого існуванням мембранного каналу.Акумулювання наночастинок золота може відбуватися не тільки на поверхні, але і всередині клітини, про що свідчать дані електронно-мікроскопічних знімків зрізів клітин золотофільного штаму бактерій після їх контакту з наночастинками золота [13, 18, 19].

Доведена можливість трансмембранного переносу наночастинок золота в клітинах золотофільних бактерій, а також визначені молекулярні структури і механізми, відповідальні за цей процес. У досліджуваних клітинах була ідентифікована АТР-азна активність, що складається з двох компонент: азидчутливої (63%) та азидрезистентної (37%). При цьому азидчутлива компонента АТР-азної активності пов'язана з функціонуванням дихального ланцюга клітини бактерій, локалізованого в плазматичній мембрані, а азидрезистентна компонента може складати молекулярну основу трансмембранного переносу наночастинок золота всередину клітини [7, 8, 33]. Це однозначно свідчить про енергозалежність процесу акумулювання наночастинок золота бактеріальними клітинами та підкреслює важливу роль мембранних ферментів у процесі взаємодії наночастинок золота з клітиною. Ці результати можуть слугувати підтвердженням припущення щодо існування каналу транспортування наночастинок золота в бактеріальну клітину [7, 8, 33].

Особливо слід зазначити, що активна взаємодія з наночастинками золота різного розміру притаманна не лише золотофільним штамам бактерій. Так, вплив наночастинок золота розміром 15-20 нм на інтенсивність росту бактеріального штаму Escherichia coli 1257 характеризується концентраційним оптимумом: у присутності наночастинок золота в концентрації 5·10⁶ мкг/мл у середовищі спостерігається стимуляція росту бактеріальних клітин, яка перевищує контрольні значення у середньому на 15 %. Інший показник функціонального стану бактеріальних клітин - швидкість викиду протонів, що відображає роботу мембранної Н⁺-АТР-ази, за дії концентрацій наночастинок золота 5·10⁹ - 5·10⁷ мкг/мл не змінюється. Наночастинки золота в концентраціях 5·10⁷ - 5·10⁶ мкг/мл призводять до підвищення рівня закиснення середовища, а у концентраціях 5·10^-4 - 5·10-¹ мкг/мл пригнічують швидкість викиду протонів [3, 6].

Вплив наночастинок золота різного розміру на Н⁺-АТР-азну активність бактеріальних клітин.

Властивість бактеріальних клітин до ефективної взаємодії з наночастинками золота визначається низкою факторів, серед яких, одним з ключових, є величина трансмембранного потенціалу, що генерується на плазматичній мембрані в результаті перерозподілу протонів між цитоплазмою та зовнішнім середовищем при функціонуванні мембранної Н⁺-АТР-ази та дихального ланцюга [7, 8, 33, 78].Мембранна Н⁺-АТР-аза є основним генератором трансмембранного потенціалу бактеріальної клітини, який забезпечує трансмембранне перенесення протонів за умов наявності енергетичних субстратів у середовищі інкубації [4]. За структурними та функціональними особливостями бактеріальну Н⁺-АТР-азу відносять до F1F₀-типу: гідрофільний глобулярний F1-комплекс містить місця зв'язування нуклеотидів та функціонує у якості АТР-ази, а мембранозв'язаний F0-комплекс функціонує як канал, що проводить протони (Н⁺). F1 - та F₀- комплекси можуть відокремлюватись один від одного [4, 56, 72]. Цей тип АТР-аз при-таманний більшості бактеріальних клітин.

Зважаючи на ключову роль цього ферменту в життєдіяльності бактеріальної клітини, вивчення його активності за умов впливу наночастинок золота є інфор-мативним показником біохімічної активності даних наночастинок.Визначена низка особливостей впливу наночастинок золота різного розміру на Н⁺-АТР-азну активність мембранних фракцій бактеріальних клітин штамів-пробіонтів та виробничих штамів-продуцентів вакцин [23, 25].

Так, інкубація наночастинок золота середнього розміру 10, 20, 30 і 45 нм у концентраціях 0,11-1,10 мкг/мл за металом з мембранними фракціями клітин штамів-пробіонтів Escherichia coli Г35№1-413 та Enterococcus faecalis Г35№4-410 не викликає суттєвих змін величин гідролізу АТР. Стимуляція цього показника для обох штамів в середньому сягає 5-10 %, порівняно з контролем.Аналіз характеру впливу наночастинок золота середнього розміру 20, 30 і 45 нм на Н⁺-АТР-азну активність мембранних фракцій нативних та регідратованих після ліофілізації бактеріальних клітин виробничих штамів-продуцентів вакцин (E.coli №4, 19, 20, 24, 25, 57 з колекції Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів) свідчить про достовірне підвищення рівня гідролізу АТР за умов впливу наночастинок золота певного розміру. Дані щодо впливу наночастинок золота середніх розмірів 20, 30 і 45 нм на величини Н⁺-АТР-азних активностей мембранних фракцій нативних та регідратованих після ліофілізації бактеріальних клітин виробничих штамів E.coli № 24 та E.coli № 57 відповідно.Так, під дією наночастинок золота розміром 20 нм достовірних змін у значенні ферментативної активності, порівняно з контролем, не спостерігається ані для нативних, ані для регідратованих клітин усіх досліджених виробничих штамів. Виключення складають нативні та регідратовані клітини штаму E.coli №24 та ре-гідратовані клітини штаму E.coli №57. Для нативних та ліофілізованих/регідратованих клітин штаму E.coli №24 Н⁺-АТР-азна активність мембранної фракції за умов впливу досліджуваних концентрацій (0,0125 - 0,2 мкг металу/мкг білку) наночастинок золота розміром 20 нм підвищується у середньому на 20-30% порівняно з контрольним значенням ферментативної активності (при відсутності контакту мембранної фракції з наночастинками золота).

Для регідратованих клітин штаму E. coli №57 за умов впливу наночастинок розміром 20 нм активація процесу гідролізу АТР досягає 20%, однак у препаратах мембранних фракцій нативних клітин цього штаму підвищення рівня гідролізу АТР не перевищує 10%.Наночастинки золота середнього розміру 30 нм, порівняно з наночастинками розміром 20 нм, виявляють стимулюючий вплив на величину Н⁺-АТР-азної активності мембранних фракцій бактеріальних клітин усіх досліджених штамів-продуцентів вакцин (E. coli №4, 19, 20, 24, 25, 57) як у нативному, так і у регідратованому стані після ліофілізації. Рівень гідролізу АТР за умов впливу наночастинок золота цього розміру підвищується, у середньому, на 10-20%, а інколи сягає 30%. Зміни величини Н⁺-АТР-азної активності за умов впливу наночастинок золота розміром 30 нм проілюстровані на прикладі штамів E. coli №24 та E. coli №57.Найбільш виражений стимулюючий ефект на величину Н⁺-АТР-азної активності мембранних фракцій як нативних, так і регідратованих після ліофілізації клітин виробничих штамів, виявляється у присутності наночастинок золота розміром 45 нм. Підвищення ферментативної активності за дії наночастинок цього розміру складає, у середньому, 30-40% та інколи сягає 50%.Отже, наночастинки золота, синтезовані методом хімічної конденсації, залежно від розміру виявляють здатність стимулювати на 20-40% Н⁺-АТР-азну ак-тивність мембранних фракцій як нативних, так і ліофілізованих/регідратованих клітин E.coli - виробничих штамів-продуцентів вакцин.Наявність такого достовірно стимулюючого ефекту на мембранну Н+-АТР-азу може бути обумовлена наступними факторами. Наночастинки золота володіють добре розвиненою активною поверхнею, площа якої визначається їх розміром та забезпечує високу реакційну здатність наночастинок [20, 36].

При цьому каталітична дія наночастинок золота може бути реалізована через безпосередній вплив на сам фермент (взаємодія з функціональними зарядженими групами білкової молекули, що приводить до певних конформаційних змін). Не виключається можливість хімічної взаємодії наночастинок з ліпідним оточенням цього мембранозв'язаного ферменту, що може викликати функціональні зміни його активності [21, 35].

Вплив наночастинок золота на проникність клітинної оболонки бактеріальних клітин.

Проникність клітинної оболонки є важливим показником функціонального стану бактеріальних клітин [37].

Ключова роль клітинної оболонки в забезпеченні нормального функціонування бактеріальних клітин обумовлена, перш за все, її структурними особливостями. Найбільш виражено розрізняються оболонки грам-позитивних та грам-негативних бактерій. Так, до складу оболонок грам-позитивних бактеріальних клітин входять цитоплазматична (внутрішня) мембрана та пептидоглікан. Грам-негативні бактеріальні клітини додатково містять зовнішню мембрану, яка структурно подібна до цитоплазматичної, проте не містить ферментних систем, а виконує захисну функцію [37, 61].Пептидоглікан являє собою полімер, до складу якого входять N-ацетилглюкозамін та N-ацетилмурамова кислота, що зв'язані між собою пептидним зв'язком. Пептидоглікан утворює каркас, який забезпечує форму та стійкість до руйнуючих факторів бактеріальних клітин [29, 37].

Клітинна оболонка ефективно захищає бактеріальну клітину від дії негативних факторів оточуючого середовища. Зменшення її міцності або руйнування призводить, у більшості випадків, до загибелі клітини. Наночастинки золота різного розміру по різному впливають на рівень проникності клітинної оболонки грам-негативних та грам-позитивних бактерій. Так, при дії наночастинок золота на проникність клітинної оболонки грам-негативного штаму Escherichia coli Г35 №1-413 спостерігається їх переважний стабілізуючий вплив.Наночастинки розміром 10 нм і 45 нм переважно виявляють стабілізуючу дію на клітинну оболонку грамнегативного штаму E. coli Г35 №1-413. Однак за концентрації 2,77 мкг/мл наночастинок золота розміром 10 нм та за концентрації 1,38 мкг/мл наночастинок золота розміром 45 нм спостерігається підвищення виходу внутрішньоклітинних метаболітів у зовнішнє середовище, що є свідченням підвищення рівня проникності клітинної оболонки бактеріальних клітин цього штаму.Стабілізуючий вплив наночастинок золота на клітинну оболонку грам-негативних бактерій можна пояснити стеричним фактором взаємодії наночастинок певного розміру з поверхнею клітини. Зокрема, можливе блокування пор, що призводить до зниження рівня виходу внутрішньоклітинних метаболітів у зовнішнє середовище.

Для грам-позитивного штаму Enterococcus faecalis Г35 №4-410 виявляються інші закономірності. Так, лише за дії наночастинок золота середнього розміру 20 нм у концентрації 1,38 мкг/мл за металом, та наночастинок розміром 30 нм у концентрації 1,10 мкг/мл за металом проникність клітинної оболонки знижується.Щодо механізму впливу, який призводить до підвищення рівня проникності клітинної оболонки грам-позитивних бактеріальних клітин, можна припустити, що наночастинки золота зв'язуються з функціональними групами пептидоглікану та тейхоєвих кислот, розташованих із зовнішнього боку клітинної оболонки. Внаслідок цього відбувається локальне структурування у місцях хімічного зв'язування наночастинок з появою дестабілізованих ділянок оболонки грам-позитивної бактеріальної клітини, що призводить до підвищення її проникності.

Р-лактамазна активність бактеріальних клітин за дії наночастинок золота.

Серед показників, які відіграють суттєву роль у функціонуванні багатьох типів бактеріальних клітин, особливо штамів-пробіонтів та патогенних штамів, слід зазначити Р-лактамазну активність. Р-лактамази являють велику групу генетично та функціонально різноманітних ферментів, що здатні руйнувати Р-лактамні антибіотики [17, 27].При конструюванні пробіотичних препаратів з метою аналізу стійкості та можливих сфер застосування штамів-пробіонтів, що входять до складу пробіотиків, Р-лактамазна активність набуває значення індикаторного показника функ-ціонального стану бактеріальної клітини.

Проведені експериментальні дослідження щодо особливостей впливу наночастинок золота на Р-лактамазну активність штаму-пробіонту E. coli Г35 №1-413 виявили стимуляцію Р-лактамазної активності, у середньому, на 30 % в діапазоні концентрацій 0,11-0,28 мкг/мл за металом [22]. Проте в діапазоні концентрації 0,3-1,1 мкг/мл за металом наночастинки розміром 10 нм інгібували цю ферментативну активність на 80 %.За дії наночастинок золота розміром 30 та 45 нм у всьому дослідженому концентраційному діапазоні спостерігається підвищення Р-лактамазної активності бактеріальних клітин штаму-пробіонту E. coli Г35 №1-413, у середньому, на 30-50%.

Таким чином, наночастинки золота певного розміру можуть викликати активацію Р-лактамазної активност бактеріальних клітин внаслідок зміни кон-формаційного стану білкової макромолекули в результаті взаємодії наночастинок з функціональними зарядженими групами.

Особливості взаємодії наночастинок золота з еукаріотичними клтинами.

Дослідження особливостей взаємодії наночастинок золота з еукаріотичними клітинами має суттєве значення у зв'язку з їх ефективністю та перспективністю застосування у боротьбі з онкологічними, серцево-судинними захворюваннями, тощо. Разом з цим, дані щодо біохімічних ефектів впливу наночастинок золота різного розміру на еукаріотичні клітини є досить обмеженими та розрізненими.

Розмір наночастинок може бути співставлений із розмірами біомолекул -компонентів клітин. Розмірний діапазон наночастинок золота (1-100 нм) обумовлює, поряд з особливими хімічними властивостями, їх унікальний характер впливу на клітинному рівні.Так, наночастинки золота середнього розміру 9 нм інгібують активність ізоферментів цитохрому Р450 (СYP 450 1А2; СYP 450 2С9; СYP 450 2С19; СYP 450 3А4). Механізм інгібуючого впливу наночастинок на активність цього гемпротеїду не з'ясований, проте, ймовірно, пов'язаний з фізико-хімічними характеристиками цих наночастинок та гідрофобним оточенням гему молекули Р450, що обумовлює можливість наночастинок золота конкурувати з субстратом ферменту [75].

Наночастинки золота середнього розміру 2 нм, функціоналізовані 2-(10-меркаптодецил)малоновою кислотою, виявляють шаперон-подібні властивості і здатні впливати на фолдинг білків та фібрілогенез [52]. Шаперон-подібні властивості наночастинок золота відкривають нові перспективи в створенні лікарських препаратів, у тому числі для лікування захворювань мозку. Проте, з іншого боку, зазначають необхідність вивчення токсичного впливу наночастинок золота.Кон'югація наночастинок золота з плазмідними ДНК та нуклеотидними послідовностями підвищує рівень їх проникнення у еукаріотичні клітини. Кон'югати, отримані у фізіологічно-прийнятних умовах, здатні проходити крізь мембрану без її ушкоджень та руйнування [76]. Це відкриває нові перспективи як для фундаментальних досліджень у галузі молекулярної біології, генетики, біохімії, фармакології, так і для прикладних завдань з розробки діагностикумів.До унікальних властивостей наночастинок золота, які мають велике значення для медицини та фармакології, відноситься здатність з різною інтенсивністю розсіювати або абсорбувати світло у видимій або близькій інфрачервоній частині спектру. Це явище дістало назву поверхневого плазмонного резонансу (ППР), і дозволяє застосовувати наночастинки золота в техніках оптичної візуалізації in vivo, таких як фотоакустика та двофотонна люмінесценція. Оскільки в близькій інфрачервоній області (700-900 нм) абсорбція усіх біомолекул є мінімальною, це забезпечує чітку оптичну візуалізацію з використанням наночастинок золота. Пік ППР може бути налаштований шляхом зміни фізико-хімічних характеристик наночастинок [11, 43].

Легкість модифікації поверхні та значний коефіцієнт поглинання рентгенівського випромінювання забезпечують високоефективне використання наночастинок золота в якості контрастних агентів у інших неінвазивних діагностичних методах, таких як магнітно-резонансна томографія та рентгенівська комп'ютерна томографія [45, 51, 54, 60, 80].

Унікальні властивості наночастинок золота роблять їх перспективним агентом у фототермальній терапії онкологічних захворювань, оскільки наночастинки золота володіють здатністю трансформувати оптичне випромінювання у тепло, що обумовлює термічне руйнування пухлинних клітин та є перспективним напрямком цільової протипухлинної терапії [43, 58, 66].

Значну увагу привертає визначення відмінностей взаємодії нормальних та пухлинних клітин з наночастинками золота, обумовлене біохімічними особливостями функціонування пухлинних клітин порівняно з нормальними клітинами [12, 26, 47, 65].

Так, на моделі пухлинних клітин лінії U937 (гістіоцитарної лімфоми людини), продемонстрована їх здатність активно акумулювати наночастинки золота усіх досліджених розмірів як на поверхні, так і всередині клітин [24].

При цьому, найбільш ефективно клітини акумулюють наночастинки золота розміром 20 і 30 нм. Представлені конфокально-мікроскопічні зображення пошарового сканування пухлинних клітин лінії U937 після їх взаємодії з наночастинками золота середнього розміру 30 нм, які підтверджують високий рівень акумуляції, про що свідчать зміни інтенсивності забарвлення на знімках (від червоного - максимум, до синього - мінімум).Експериментально встановлено [24], що взаємодія клітин лінії U937 з наночастинками золота характеризується вираженими концентраційними залежностями в діапазоні концентрацій 10¹-10⁶ клітин/мл для наночастинок усіх вивчених розмірів.

Так, максимум зв'язування наночастинок розміром 10 і 20 нм пухлинними клітинами становить 10³ клітин/мл. При цьому слід відмітити, що крива зв'язування наночастинок золота розміром 10 нм проходить через мінімум при концентрації клітин 10⁵ клітин/мл, що може бути наслідком зменшення активної поверхні пухлинних клітин у результаті їх флокуляції. При цьому, подальше збільшення, на порядок, концентрації клітин призводить до підвищення акумуляції наночастинок золота до максимального рівня через збільшення площі активної поверхні. Тобто, в системі клітин з наночастинками розміром 10 нм концентрація 10⁵ клітин/мл є критичною для міжклітинної взаємодії.

Концентраційна крива зв'язування наночастинок розміром 30 нм відрізняється від двох попередніх розширеним максимумом, який знаходиться у діапазоні концентрацій 10³ - 10⁵ клітин/мл.

Що стосується наночастинок золота розміром 45 нм, то крива зв'язування практично виходить на плато в діапазоні концентрацій 10³ - 10⁶ клітин/мл і характеризується слабо вираженим максимумом у концентрації 10⁴ клітин/мл.Зміни ефективності взаємодії пухлинних клітин з наночастинками золота найбільш ймовірно пов'язані: в області малих концентрацій клітин - із токсичним впливом наночастинок золота, в області високих концентрацій клітин - із зменшенням площі активної поверхні контакту клітин з наночастинками в зв'язку із переважною міжклітинною взаємодією. Тобто, існують певні оптимальні співвідношення концентрацій клітин та наночастинок золота, які визна-чають ефективність зв'язування.

У перерахунку на одну клітину концентраційний оптимум взаємодії наночастинок золота з клітинами лінії U937 знаходиться у діапазоні ~(0,1-1,0) нг металу для наночастинок усіх досліджених розмірів.Вивчення кінетики цього процесу свідчить, що процес взаємодії характеризуєтся високою швидкістю: максимум зв'язування наночастинок золота пухлинними клітинами досягається протягом 3-5 хв.

Слід відзначити, що для наночастинок розміром 10 нм, після досягнення максимального рівня акумуляції у пухлинних клітинах лінії U937 (гістіоцитар-ної лімфоми людини), має місце зворотний ефект - зменшення рівня зв'язування з часом. Це може бути обумовлено здатністю пухлинних клітин до активного "викиду" наночастинок цього розміру.

Здатність пухлинних клітин до активного "викиду" токсичних для них речо-вин є одним з механізмів резистентності до протипухлинних препаратів. Частіш за все вона обумовлена активністю білків, які являють собою "помпи" (Р-глікопротеін (Pgp-170), MRP, LRP, VMAT, ARX), що здатні інтенсивно "викачувати" лікарські препарати з пухлинних клітин [28, 39]. Найбільш дослідженим є білок Pgp-170 та пов'язана з ним резистентність до лікарських препаратів. Pgp-170 - член суперсімейства АТР-залежних мембранних транспортних білків - є білком плазматичної мембрани. Його основна функція у організмі - захист клітин від токсичного впливу. Гіперекспресія цього білку в пухлинних клітинах призводить до зменшення внутрішньоклітинного накопичення протипухлинних препаратів внаслідок поси-леного викиду лікарської речовини з клітини. Активність Pgp-170 визначає резис-тентність ракових клітин до багатьох протипухлинних препаратів [39].

Механізми активного "викиду" токсичних речовин, притаманні пухлинним та бактеріальним клітинам, мають ряд спільних рис, головна з яких - це використання енергії АТР та функціонування білків-транспортерів для активного "викиду" токсичних для клітин речовин [41].

Після потрапляння у клітину наночастинки золота, залежно від їх розміру, мають різну локалізацію.

Судячи з даних електронно-мікроскопічного аналізу можна говорити про переважне накопичення наночастинок золота розміром 10 нм та 20 нм у вакуолях. Для наночастинок золота розміром 30 і 45 нм спостерігається їх переважна акумуляція лізосомами.

Вплив наночастинок золота на ферментативну активність пухлинних клітин.

Ферментні системи є досить чутливими біохімічними індикаторами впли-ву різних факторів зовнішнього середовища на клітину. Особливо це стосується мембранозв'язаних ензимів: Na⁺,К⁺-АТР-азної та Mg²⁺-АТР-азної активності мембранної фракції клітин лінії U937. Виражені зміни, за присутності наночастинок золота в середовищі інкубації, спостерігаються у величині Na⁺,К⁺-АТР-азної активності мембранної фракції пухлинних клітин [24].

Зміни величини Na⁺,К⁺-АТР-азної активності (А/А₀, %) мембранної фракції пухлинних клітин лінії U937 за умов впливу наночастинок золота розміром: 1 - 10 нм, 2 - 20 нм, 3 - 30 нм, 4 - 45 нм. (M±m; n=5, Р < 0,05 відносно контролю - А₀). За 100 % (контроль) прийнята величина Na⁺,К⁺-АТР-азної активності за відсутності наночастинок золота.Так, наночастинки золота розміром 10 нм, у діапазоні концентрацій 0,11-1,1 мкг/мл, інгібують ферментативну активність на 70 %, порівняно з контролем. Інгібування Na⁺,K⁺-АТР-азної активності, в присутності наночастинок золота розміром 20 нм, складає 20 %. Наночастинки золота 30 нм, в діапазоні концентрацій 0,11-1,10 мкг/мл, стимулюють Na⁺,K⁺-АТР-азну активність: значення показника із підвищенням концентрації наночастинок зростає і сягає 30-40% у концентраційному діапазоні 0,28-1,10 мкг/мл. За умов впливу наночастинок золота розміром 45 нм спостерігається підвищення Na⁺,K⁺-АТР-азної активності на 20-40%. Так, у межах концентрацій наночастинок золота 0,11-0,28 мкг/мл за металом стимуляція Na+,K+-АТР-ази дорівнює 20%. У концентраційному діапазоні 0,28-0,55 мкг/мл за металом ферментативна активність зростає від 20% до 40% і становить, у середньому, 40 % за концентрацій наночастинок золота 0,55-1,10 мкг/мл за металом.Mg²⁺-АТР-азна активність мембранної фракції пухлинних клітин лінії U937 за умов впливу наночастинок золота середніх розмірів 10, 20, 30 і 45 нм достовірно не змінюється. Особливості впливу наночастинок золота на Na⁺,K⁺-АТР-азнуактивність мембранної фракції пухлинних клітин лінії U937 можуть бути обу-мовлені взаємодією наночастинок певного розміру (як наслідок стеричної відпо-відності) з SH-групами молекули ферменту, які відповідають за його конформаційний стан.

Лактатдегідрогеназна активність цитозольної фракції пухлинних клітин лінії U937.

Особливе місце в злоякісному переродженні клітини займають зміни вуглеводного обміну. Вони характеризуються аеробним гліколізом, результатом якого є розпад вуглеводів до пірувату та подальше перетворення його в молочну кислоту в присутності кисню (ефект Варбурга) [26].

На даний час аеробний гліколіз вважається найбільш загальною ознакою метаболізму пухлин [57]. За таких умов функціонування лактатдегідрогенази відіграє значну роль у забезпеченні пухлинної клітини енергією [73, 74]. Підвищення активності цього ферменту в сироватці крові багато років виступає маркером прогресування онкологічного захворювання [38]. Крім того, роль лактатдегідрогенази в енергетичному обміні еукаріотичної клітини робить цей фермент біохімічним індикатором токсичного впливу речовин, у тому числі наноматеріалів різноманітного походження [49, 59, 81]. У зв'язку з вищезазначеним, визначення особливостей впливу наночастинок золота різного розміру та концентрації на лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції пухлинних клітин лінії U937 являє значний теоретичний та практичний інтереси.

Експериментально встановлено [22], що при дії наночастинок золота розміром 10 нм спостерігається значна стимуляція лактатдегідрогеназної активності. Так, за концентрації наночастинок золота 0,15 мкг/мл активность цього ферменту підвищується у 4,5 рази. Рівень підвищення лактатдегідрогеназної активності в 1,5-2 рази зберігається на ділянці концентрацій 0,3-0,6 мкг/мл за металом та знову зростає до 4,5 разів у концентраційних межах 0,6-1,2 мкг/мл за металом.

Підвищення лактатдегідрогеназної активності, в середньому, в 1,5-2,5 рази, порівняно з контролем, спостерігається за дії наночастинок розміром 20 нм і 30 нм. Наночастинки 45 нм у концентраційному діапазоні 0,15-0,6 мкг/мл за металом виявляють інгібуючий вплив на цю ферментативну активність. Величина пригнічення зменшується з ростом концентрації наночастинок у діапазоні 0,6-1,2 мкг/мл за металом із переходом до стимуляції майже у 2 рази.

Особливості впливу наночастинок золота різного розміру на лактатдегідроге-назну активність цитозольної фракції пухлинних клітин можуть бути пов'язані з відмінностями в стеричній комплементарності при взаємодії з основними амі-нокислотами (аргініном та гістидином) активного центру ферменту.Загалом слід зазначити, що за наведеними біохімічними та фізико-хімічними показниками найбільш вираженим токсичним впливом на пухлинні клітини гістіоцитарної лімфоми людини характеризуються наночастинки золота розміром 10 нм.Наночастинки золота розміром 30 нм та 45 нм, за характером біологічної дії, є найбільш біосумісними, що вказує на перспективність їх використання як векторів цільової онкотерапії.

Вплив наночастинок золота на співвідношення білкових фракцій плазми крові щурів.

Вміст білкових фракцій крові є чутливим індикатором фізіологічного стану організму людини і тварин, впливу чинників зовнішнього середовища, має велике прогностичне значення та відіграє суттєву роль у виборі максимально ефективного плану терапії [42, 77].

На сьогодні наночастинкам золота приділяється значна увага в медицині у зв'язку з їх використанням у технологіях конструювання високоефективних засобів діагностики та цільової терапії, зокрема онкологічних захворювань [46, 53, 54]. Проте дані щодо особливостей впливу наночастинок золота на біохімічні процеси в органах і тканинах тварин при введенні в кров'яне русло, їх циркуля-ції, розподілу та елімінації, практично відсутні. Наведено зміни вмісту білкових фракцій в плазмі крові щурів у нормі порівняно з контролем (тварини без ін'єкції препаратів наночастинок золота) через 1 годину після внутрішньовенного введення препаратів наночастинок золота середнього розміру 20, 30 та 45 нм .Через 1 годину після внутрішньовенного введення препаратів наночастинок розміром 20 нм і 45 нм спостерігається незначне підвищення (на 10%) вмісту загального білку (ЗБ) в плазмі крові щурів, тоді як вплив наночастинок розміром 30 нм викликає зменшення цього показника на 10 %.

Вміст альбумінів (АЛБ) у плазмі крові піддослідних тварин знижується, у середньому, на 10-15 % після введення наночастинок усіх досліджених розмірів.Зниження вмісту а₁ -глобулінів (а1-ГЛБ) під впливом наночастинок золота розміром 20 і 45 нм складає, у середньому, 15-20 %, а наночастинок розміром 30 нм - 24 %. Вміст а₂-глобулінів (а₂-ГЛБ) через 1 годину після введення наночастинок розміром 20 і 45 нм достовірно не змінюється, однак спостерігається збіль-шення цього показника на 27 % за дії наночастинок розміром 30 нм. Кількість Р-глобулінів (Р-ГЛБ) у плазмі крові піддослідних тварин при введенні наночастинок золота розміром 20 нм достовірно не змінюється, наночастинки розміром 30 нм сприяють зниженню цього показника, у середньому, на 17%, а частинки розміром 45 нм - його підвищенню на 16 %, порівняно з контролем.Найбільш виражено за умов впливу наночастинок золота змінюється вміст у-глобулінів (у-ГЛБ). У плазмі крові тварин через 1 годину після внутрішньовенного введення наночастинок кількість -ГЛБ збільшується, у середньому, на 22% за дії наночастинок розміром 20 нм і 45 нм. Вплив наночастинок розміром 30 нм викликає підвищення вмісту у-глобулінів, у середньому, на 37%. Оскільки -глобулінова фракція містить антитіла, це може свідчити про напруження імун-ної системи організму тварин через 1 годину після ін'єкції наночастинок, яке є максимальним при введенні наночастинок золота розміром 30 нм.Через 24 години після ін'єкції спостерігається тенденція до нормалізації вмісту білкових фракцій в плазмі крові піддослідних тварин.

Так, за умов впливу наночастинок золота розміром 20 нм спостерігається незначне зменшення (на 10 %) вмісту білку, а значення цього показника при введенні наночастинок розміром 30 та 45 нм наближається до його значення у контролі. Вміст альбумінів підвищується, порівняно з контролем, на 24 % та 14% для наночастинок розміром 20 нм та 30 нм відповідно, а для наночастинок розміром 45 нм величина досягає контрольного рівня.

Кількість а₁-глобулінів через 24 години після введення препарату наночастинок розміром 20 нм на 12 % менша за відповідне значення кількості а1-глобулінів у контролі. Для наночастинок розміром 30 нм зниження показника рівня а₁-глобулінів складає, у середньому, 17%, для наночастинок розміром 45 нм вміст а₁ -глобулінів підвищується майже до контрольного рівня. Підвищення вмісту а₂-глобулінів на 23 % і 15% відповідно реєструється за умов впливу на-ночастинок розміром 20 нм і 30 нм, частинки розміром 45 нм на цей показник істотно не впливають. Рівень Р-глобулінів у плазмі крові тварин знижується, у середньому, на 15% за умов введення наночастинок розміром 30 і 45 нм та на 24% - під впливом частинок розміром 20 нм. Вміст у-глобулінів наближається до значення їх показника в контролі за умов впливу наночастинок золота розміром 30 і 45 нм та знижується на 9 % при дії наночастинок розміром 20 нм.У тварин з перещепленою карциномою Герена, резистентною до цисплатину через 1 годину після ін'єкції вміст золота реєструється у наступних органах: моз-ку (26,09±3,15 нгAu/г тканини), нирках (51,40±6,23 нгAu/г тканини), селезінці (60,00±5,78 нг Au/г тканини) та печінці (37,60±4,07 нг Au/г тканини).

Проте, через 24 години після ін'єкції, рівень накопичення наночастинок золота в печінці, селезінці та нирках істотно зменшується і складає, відповідно, 12,7±1,92 нгAu/г тканини у печінці, а у селезінці та нирках взагалі не фіксується. Це вказує на провідну роль цих органів у детоксикації та виведенні наночастинок золота з організму.Особливої уваги заслуговує факт накопичення золота в мозку через 1 годину після введення. Це вказує на здатність наночастинок золота цього розміру долати гематоенцефалічний бар'єр. Вільний перетин гематоенцефалічного бар'єру наночастинками золота певного розмірного діапазону свідчить про можливість та перспективність їх використання у розробці діагностикумів та лікарських препаратів цільової терапії пухлин головного мозку людини, що є дуже актуальною проблемою у сучасній онкодіагностиці та онкотерапії.

Щодо пухлин, то через 1 годину після ін'єкції у них реєструється найвищий, порівняно з вмістом у органах, рівень накопичення наночастинок золота (78,90±5,27 нг Au/г тканини), який і через 24 години залишається на високому рівні та складає 31,7±2,69 нг Au/г тканини, що більш ніж у 2 рази перевищує залишкову концентрацію золота в печінці - єдиному з органів, де золото фіксується через 24 години після введення.Таким чином, при внутрішньовенному введенні препаратів наночастинок золота тваринам у нормі відбувається швидке повне їх виведення з організму; в тварин-пухлиноносіїв спостерігається переважне накопичення наночастинок золота в пухлинах як через 1, так і через 24 години. Це вказує на високу афінність наночастинок золота до пухлинних клітин в організмі тварин-пухлиноносіїв. Така вибірковість накопичення наночастинок золота обумовлює перспективність їх використання як векторів для цільової доставки протипухлинних пре-паратів.

Вплив наночастинок золота різного розміру на генетичний апарат клітин in vitro та in vivo.

Застосування препаратів наночастинок золота в біотехнології, медицині та фармакології у діагностичних чи терапевтичних цілях повинно бути обґрунтоване науковими доказами їх біобезпечності. Це досягається дослідженнями in vitro та in vivo, які включають оцінку дії наночастинок на клітини органів і тканин. Особливої уваги заслуговують результати щодо вивчення особливостей впливу наночастинок золота на генетичний апарат клітини.При визначенні впливу наночастинок золота на генетичний апарат клітин для біобезпечного використання наночастинок особливого значення набуває оцінка зміни структурного стану ДНК (генотоксичності) еукаріотичних клітин різних типів [50]. Найбільш перспективним методом оцінки зміни структурного стану ДНК під впливом наночастинок є метод "ДНК-комет" (лужного гельелектрофорезу ізольованих клітин), рекомендований Європейською комісією з оцінки ризиків застосування наноматеріалів. Цей метод характеризується висо-кою чутливістю, експресністю, високим рівнем відтворюваності результатів.

Вплив наночастинок золота на структурний стан ДНК еукаріотичних клітин лінії U937 та СНО-К1.

Проникнення наночастинок золота всередину клітини є обов'язковою умовою для оцінки їх впливу на структурний стан ДНК ізольова-них клітин.На рис. 25 наведені дані, які відображають рівень ушкодження структурного стану ДНК нативних клітин лінії СНО-К1 після 30 хв інкубації з наночастинка-ми золота за показником "% ДНК в хвості" [10].

За даними дія наночастинок розміром 10 нм викликає фрагментацію ДНК, рівень якої складає близько 15% за показником "% ДНК в хвості". Значення цього показника значно перевищує аналогічну величину негативного контролю (1%) та наближене до величини позитивного контролю (19%). Фрагментація ДНК спостерігається і за дії наночастинок золота середнього розміру 20 нм у всіх досліджених концентраціях. Ці дані свідчать про те, що наночастинки золота розміром 10 і 20 нм, у вивчених концентраціях, здатні порушувати структурний стан ДНК клітин лінії СНО-К1.Водночас наночастинки золота середнього розміру 30 і 45 нм не впливають на структурний стан ДНК клітин лінії СНО-К1. Величина "% ДНК в хвості" складає 1,5% та 1,3% (к, л) відповідно, що майже співпадає з аналогічною величиною негативного контролю.

Метаболіти, що утворюються в живому організмі як продукти біотранс-формації речовин, у тому числі і наночастинок металів, також можуть пошкоджувати структурний стан ДНК. Тому для виявлення потенційної мутагенності наночастинок золота обов'язковими є дослідження з моделюванням умов живого організму, для цього застосовують ферменти печінки щурів - фракції S9 [5, 62].

За даними показники, які характеризують структурний стан ДНК клітин лінії СНО-К1 за дії наночастинок золота розміром 30 та 45 нм, у присутності фракції S9 знаходяться майже на рівні негативного контролю (1%) і становлять 1,6% та 0,6% відповідно. Отже, наночастинки золота розміром 30 і 45 нм, навіть у системі з використанням метаболічної активації, не впливають на структурний стан ДНК клітин лінії СНО-К1.

Дані щодо характеру впливу наночастинок золота різного розміру на структурний стан ДНК пухлинних клітин лінії U937 є аналогічними. Наведені дані щодо характеру впливу наночастинок золота розміром 10, 20, 30 та 45 нм на структурний стан ДНК клітин лінії U937.Так, наночастинки розміром 10 та 20 нм ушкоджують структурний стан ДНК клітин лінії U937: величина фрагментації ДНК за умов впливу наночастинок золота розміром 10 нм становить близько 27% за показником "% ДНК в хвості", що значно перевищує аналогічну величину негативного контролю та спів-падає з величиною позитивного контролю.Подібна картина спостерігається і для препаратів наночастинок золота розміром 20 нм.

Наночастинки золота середнього розміру 30 та 45 нм не впливають на структурний стан ДНК пухлинних клітин лінії U937 (величина "% ДНК в хвості" складає 3,4% та 2,9% відповідно, що майже співпадає з показником негативного контролю). Вплив наночастинок золота на структурний стан ДНК еукаріотичних клітин обумовлений здатністю наночастинок певного розміру проникати через пори ядерної мембрани та безпосередньо взаємодіяти з молекулою ДНК.

Так, за даними Rout M. P. [69] середній розмір ядерних пор складає 20-30 нм. Тому наночастинки, розмір яких перевищує розмір пор, не здатні проникати всередину ядра та впливати на ДНК.Окрім цього, в умовах безпосереднього впливу наночастинок золота на ДНК, велике значення мають розмір та заряд наночастинки, а також заряд молекули ДНК та гістонових білків. Розміри нуклеосоми і перемичок можуть визначати стеричну комплементарність наночастинок золота та відповідних ділянок комплексу "ДНК-гістон". При цьому взаємодія може відбуватись за рахунок утворен-ня електростатичних зв'язків негативно зарядженої наночастинки золота з позитивно зарядженими аміногрупами гістонових білків. Ці зв'язки можуть бути міцнішими порівняно із зв'язками, що стабілізують комплекс "ДНК - гістонові білки", що може призвести до дестабілізації структури ДНК та появи одно та двониткових розривів.Таким чином, наночастинки золота середнього розміру 10 і 20 нм здатні порушувати структурний стан ДНК при взаємодії з еукаріотичними клітинами в умовах in vitro, що свідчить про генотоксичність наночастинок цих розмірів.

Наночастинки розміром 30 і 45 нм не впливають на структурний стан ДНК еукаріотичних клітин обох типів, що є ознакою їх біобезпечності.

Вивчення генотоксичної дії наночастинок золота різного розміру в експериментах in vivo.

При обґрунтуванні можливості введення наночастинок золота певного розміру в кров'яне русло обов'язковим є визначення характеру їх впливу на генетичний апарат клітин - потенційних органів-мішеней.Так, наночастинки золота розміром 20, 30 і 45 нм не проявляють генотоксичної дії на клітини печінки, нирок, кишківника, кісткового мозку. Показники ушкодження структурного стану ДНК ("%ДНК в хвості") знаходяться на рівні аналогічного показнику негативного контролю.Однак у клітинах селезінки наночастинки золота розміром 20 нм спричинюють пошкодження ДНК на рівні 21 % за показником "% ДНК в хвості" (при рівні негативного контролю 0,3 %). Виходячи з вищевикладеного можна зазначити, що за характером впливу наночастинок золота різного розміру на генетичний апарат клітин in vitro та in vivo наночастинки золота розміром 30 нм є найбільш біосумісними та біобезпечними та можуть бути рекомендовані для використання в нанобіотехнології, на-номедицині та нанофармакології.

Підсумовуючи дані цього розділу монографії щодо особливостей впливу наночастинок золота різного розміру на біологічні системи різного рівня організації можна зазначити, що дослідження особливостей біологічної дії наноматеріалів має особливе значення як з точки зору їх практичного застосування у нанобіотехнології, наномедицині та нанофармакології, так і оцінки рівня їх біобезпеки.Адекватними методами визначення такого впливу можуть виступати ключові системні характеристики живого організму (фізіологічні, біохімічні, імунологічні, генетичні тощо), які є високочутливими до дії наноматеріалів, про що свідчать дані, наведені в даному розділі.

1. ЛІТЕРАТУРА
2. Амосова Л. А. Разработка способа получения поверхностных протективных антигенов S. dublin и S. typhimurium при помощи солянокислого гидроксиламина и мочевины для изготовления компонентов вакцины против сальмонеллеза крупного рогатого скота / Л. А. Амосова, Ю. В. Ломако, Н. В. Москалева // Весці Нац. Акад. навук Беларусі. - 2009. - № 4. - С. 86-91.
3. Богатырев В. А. Методы синтеза наночастиц с плазмонным резонансом / Богатырев В. А., Дыкман Л. А., Хлебцов Н. Г. - Саратов, 2009. - 85 с.
4. Вплив важких металів у колоїдній та іонній формах на ростові процеси Escherichia coli 1257 / В. В. Вембер, Т. Г. Грузіна, Т. П. Чеховська [та ін.] // Наукові Вісті НТУУ "КПІ". - 2003. - № 6. - С. 132-137.
5. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции / Р. Геннис. -М.: Мир, 1997. - 624 с.
6. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта. - М.: "Мир", Т. 2. -1984. - 472 с.
7. Влияние коллоидного золота на физиолого-биохимические процессы Escherichia coli 1257 / Т. Г. Грузина, Т. П. Чеховская, В. В. Вембер [и др.] // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т. 75, № 3. - С. 95-98.
8. Ідентіфікація та каталітичні властивості Mg²⁺ - залежної АТР-гідролази плазматичних мембран Bacillus spB 4253, здатних до накопичення золота / Г. В. Данилович, Т. Г. Грузіна, З. Р. Ульберг [та ін.] // Укр. біохім. журн. -2004. - Т. 76, № 5. - С. 45-51.
9. Вплив іонного та колоїдного золота на АТР-гідролазні ферментні системи в мембрані мікроорганізмів Bacillus sp B4253 та Bacillus sp В4851 / Г. В. Данилович, Т. Г. Грузіна, З. Р. Ульберг [та ін.] // Укр. біохім. журн. - 2007. -Т. 79, № 4. - С. 46-51.
10. Аналіз генотоксичності наночастинок золота методом лужного гель-електрофорезу ізольованих еукаріотичних клітин / С М. Дибкова, Л. С. Рєзні-ченко, Т. Г. Грузіна [та ін.] // Доповіді НАНУ. - 2010. - №3. - С. 166-170.
11. Оцінка in vivo ДНК-ушкоджувальної дії наночастинок золота різного розміру / С. М. Дибкова, Л. С. Рєзніченко, Т. Г. Грузіна [та ін.] // Біотехнологія. -2010, Т. 3, №3. - С. 66-71.
12. Дыкман Л. А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии / Л. А. Дыкман, В. А. Богатырев // Успехи химии. - 2007. - Т. 76, № 2. - С. 199-213.
13. Капля А. А. Изоферменты Na+, K+-АТР-азы и Ca2+-АТР-азы в злокачественных новообразованиях / А. А. Капля, С. В. Хижняк, А. Г. Кудрявцева // Укр. біо-хім. журн. - 2006. - Т. 78, № 1. - С. 29-41.
14. Исследование роли структуры компонентов поверхности микроорганизмов в гетерокоагуляции с частицами коллоидного золота / В. И. Карамушка, З. Р. Ульберг, Т. Г. Грузина [и др.] // Прикл. Биохим. Микробиол. - 1987. - Т.23, Вып. 5. - С. 697-702.14. Коваленко Н. К. Скрининг штаммов молочно-кислых бактерий, обладающихгипохолестеринемической активностью, и их практическое использование /Н. К. Коваленко, С. А. Касумова, Ф. В. Мучник // Мікробіол. журн. - 2004.- Т. 66, № 3. - С. 33-42.
15. Кройт Г. Р. Коллоиды / Кройт Г. Р.; под ред. проф. В. Н. Крестинской. - Л.: Химтеорет, 1936. - 240 с.
16. Дисбактериоз кишечника (клиника, диагностика, лечение): Руководство для врачей / [Ю. В. Лобзин, В. Г. Макарова, Е. Р. Корвякова и др.]. - Спб.: Издательство ФОЛИАНТ. - 2003. - 256с.
17. Беталактамные соединения. Взаимосвязь структуры и биологической активности / П. С. Ныс, В. Б. Курочкина, А. В. Скляренко [и др.] // Антибиот. Химиотерап. - 2000. - № 11. - С. 36-42.
18. Роль биохимических факторов в селективной гетерокоагуляции микроорганизмов с частицами коллоидного золота / Ф. Д. Овчаренко, З. Р. Ульберг, В. И. Карамушка [и др.] // ДАН СССР. - 1986. - Т. 287, № 4. - С. 1009-1012.
19. Біохімічні механізми селективності взаємодії мікроорганізмів з металами / Ф. Д. Овчаренко, З. Р. Ульберг, М. В. Пєрцов [та ін.] // Вісник АН УРСР. -1988. - №2. - С. 11-21.
20. Петров Ю. И. Кластеры и малые частицы / Ю. И. Петров. - М.: Наука, 1982. - 360 с.
21. Рапопорт А. И. Структурно-функциональные перестройки в клетках при обезвоживании-регидратации / А. И. Рапопорт, Э. Ю. Вентыня // Торможение жизнедеятельности клеток. - Рига: Знатнее, 1987. - С. 85-119.
22. Рєзніченко Л. С. Біохімічні ефекти впливу наночастинок золота на прока-ріотичні та еукаріотичні клітини / дис. на здобуття ступ. канд. біол. наук.
23. - Київ, 2010. - 148 с.23. Вплив металів-мікроелементів на функціональний стан бактерій-пробіонтів/ Л. С. Рєзніченко, Т. Г. Грузіна, В. В. Вембер [та ін.] // Укр. біохім. журн.- 2008. - Т. 80, № 1. - C. 96-101.24.
24. Контактна взаємодія наночастинок золота з пухлинними клітинами: впливрозміру та концентрації / Л. С. Рєзніченко, С. І. Шпильова, Т. Г. Грузіна [таін.] // Доповіді НАНУ. - 2010. - №2. - С. 170-174.
25. Вплив наночастинок золота та срібла на АТР-азну активність нативних і регідратованих клітин Escherichia coli / М. Є. Романько, Л. С. Рєзніченко, Т. Г. Грузіна [та ін.] // Укр. біохім. журн. - 2009. Т. 81, №6. - С. 70 -76.
26. Сейц И. Ф. Молекулярная онкология: (Руководство для врачей) / И. Ф. Сейц, П. Г. Князев. - Л.: "Медицина", 1986. - 352 с.
27. Сидоренко С. В. Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое значение и методы детекции / С. В. Сидоренко // Инф. Антимикроб. Терап. - 2002. - Т. 4, № 6. - С. 1 -14.
28. Ставровска А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / А. А. Ставровска // Биохимия. - 2000 - № 65, Вып. 1 - С. 112 -126.
29. Стейниер Р. Мир микробов / Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. - М.: Мир, Т. 2. - 1979. - 334 с.
30. Сумм Б. Д. Коллоидно-химические аспекты нанохимии - от Фарадея до При-гожина / Б. Д. Сумм, Н. И. Иванова // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. химия. - 2001. - Т. 42, № 5. - С. 300 -305.
31. Ульберг З. Р. Нанотехнології в медицині: роль колоїдно-хімічних процесів / З. Р. Ульберг, Т. Г. Грузіна, О. В. Карпов // Вісник НАНУ. - 2008. - № 8. - С. 28 -41.
32. Ульберг З. Р. Определение локализации и выделения фактора, связывающего коллоидные частицы золота / З. Р. Ульберг, В. И. Карамушка, Т. Г. Грузина // Биотехнология. - 1986. - № 1. - С. 109 -115.
33. Влияние протонофоров на гетерокоагуляцию бактериальных клеток и минеральных частиц / З. Р. Ульберг, В. И. Карамушка, Т. Г. Грузина [и др.] // Коллоидн. журн. - 1990. - Т.52, №1. - С. 172 -175.
34. Коллоидно-химический механизм связывания металлов микроорганизмами / З. Р. Ульберг, Т. А. Полищук, Л. Г. Марочко [и др.] // Коллоидн. журн. - 1994. - Т. 58, №4. - С. 584 -588.
35. Харчук И. А. Анабиоз: основные понятия и сопровождающие его процессы / И. А. Харчук // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 62 -78.
36. Чекман І. С. Наночастинки: властивості та перспективи застосування / І. С. Чек ман // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, № 1. - С. 122 -129.
37. Шарон Н. Стенка бактериальной клетки / Н. Шарон // Молекулы и клетки. - 1970. - Вып. 5. - С. 106 -117.
38. Активность лактатдегидрогеназы при раке молочной железы / О. П. Шато-ва, Б. Г. Борзенко, Д. А. Хилько [и др.] // Питання експериментальної та клінічної медицини. - 2008. - Т. 1, Вип. 12. - С. 197 -203.
39. Действие липосомального доксорубицина на клетки линии, экспрессирующие активный PGP170 / И. Б. Шоуа, А. П. Полозкова, Н. А. Оборотова [и др.] // Рос. Биотерапевт. Журн. - 2004. - Т. 3, №1. - С. 20 -23.
40. Коллоидно-химические основы нанонауки / под. ред. А. П. Шпака, З. Р. Ульберг. - К.: Академпериодика, 2005. - 466 с.
41. Янева О. Д. Механизмы устойчивости бактерий к ионам тяжелых металлов / О. Д. Янева // Мікробіол. журн. - 2009. - Т. 71, № 6. - С. 54 -65.
42. Al-Joudi F. S. Prognostic value of an index for serum globulin compensation in colon and breast cansers / F. S. Al-Joudi // Singapore Med. J. - 2005. -Vol. 46, № 12. - P. 710-713.
43. Gold nanoparticles designed for combining dual modality imaging and radiotherapy / C. Alric, R. Serduc, C. Mandon [et al.] // Gold Bulletin. - 2008. -Vol. 41, № 2. - P. 90-97.
44. Novel one-step synthesis of amin-stabilized aqueous colloidal gold nanoparticles / M. Aslam, L. Fu, M. Su [et al.] // J. Mater. Chem. - 2004. - № 14. -P. 1795-1797.
45. Application of gold nanoparticles in cancer nanotechnology / W. Cai, T. Gao, H. Hong [et al.] // J. Nanotech. Sci. Appl. - 2008. - № 1. - P.17-32.
46. Colloidal gold nanoparticles as a blood-pool contrast agent for x-ray computed tomography in mice / Q. Y. Cai, S. H. Kim, K. S. Choi [et al.] // Invest. Radiol. -2007. - Vol. 42, № 12. - P. 797-806.
47. Role of DNA hypomethylation in the development of the resistance to doxorubicin in human MCF-7 breast adenocarcinoma cells / V. F. Chekhun, G. I. Kulik, O. V. Yurchenko [at al.] // Cancer Lett. - 2006. - Vol. 231, № 1. - P. 87-93.
48. Chen Po. C. Gold nanoparticles: from nanomedicine to nanosensing / Po. C. Chen, S. C. Mwakwari, A. K. Oyelere // J. Nanotech. Sci. Appl. - 2008. - № 1. -P. 45-66.
49. Decker T. A quik and simple methods for quantitation of lactate dehydrogenase release in measurement of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity / T. Decker, M. L. Lohmann-Matther // J. Immunol. Methods. - 1998. -№ 15. - P. 61-67.
50. Methods in Molecular Biology. In Situ Detection of DNA Damage. Methods and protocols. / Edited by V. Didenko. - Humana Press, 2002. - 279 р.
51. El-Sayed I. H. Surface plasmon resonance scattering and absorption of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics: applications in oral cancer / I. H. El-Sayed, X. Huang, M. A. El-Sayed // Nano Lett. - 2005. -№ 5. - P. 829-834.
52. Fei L. Effect of nanoparticles on protein folding and fibrillogenesis / L. Fei, Sarah Perrett // Int. J. Mol.Sci. - 2009. - № 10. - P. 646-655.
53. Hetero-bifunctional poly(ethylene glycol) modified gold nanoparticles as an intracellular tracking and delivery agent / W. Fu, D. Shenoy, J. Li [et al.] // NSTI-Nanotech. - 2005. - Vol. 1. - 324-327.
54. Gold nanoparticles: a new X-ray contrast agent / J. F. Hainfeld, D. N. Slatkin, T. M. Focella [et al.] // Br. J. Radiol. - 2006. - № 79. - P. 248-253.
55. Characterization of nanoparticles for therapeutics / J. B. Hall, M. A. Dobrovolskaia, A. K. Patri [et al.] // Nanomedicine. - 2007. - Vol. 2, № 6. - P. 789-803.
56. Hoppe J. The proton conducting F0-part of bacterial ATP synthases / J. Hoppe, W. Sebald // Biochem. Biophys. Acta. - 1984. - № 768. - P. 1-27.
57. Hsu P. P. Cancer cell metabolism / P. P. Hsu, D. M. Sabatini // Cell. - 2008. -№ 5. - P. 703-707.
58. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods / X. Huang, I. H. El-Sayed, W. Qian [et al.] // J. Am. Chem. Soc. - 2006. - No.128. - P. 2115 -2120.
59. Jurisic V. In vitro assays for cell death determination / V. Jurisic // Arch. Oncol. - 2008. - Vol. 16, № 3 -4. - P. 49 -54.
60. Immunotargeted nanoshells for integrated cancer imaging and therapy / C. Loo, A. Lowery, N. Halas [et al.] // Nano Lett. - 2005. - Vol. 5, № 4. - P. 709 -711.
61. Lugtenberg C. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other gram-negative bacteria / C. Lugtenberg, L. Alphen // Biochem. Biophys. Acta. - 1983. - Vol. 733, № 1. - P. 51 -115.
62. Maron D. M. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test / D.M. Maron, B. N. Ames // Mutat. Res. - 1983. - Vol. 113. - P. 173 -215.
63. Merroun M. L. Interactions between metals and bacteria: fundamental and applied research / M. L. Merroun // FORMATEX. - 2007. - P. 108 -119.
64. Electrochemical immunosensor based on polythionine/gold nanoparticles for the detection of aflatoxin B1 / J. Owino, O. A. Arotiba, N. Hendricks [et al.] // Sensors. - 2008. - № 8. - P. 8262 -8274.
65. Colloidal gold: novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery / G. F. Paciotti, L. Myer, D. Weinreich [et al.] // Drug Deliv. - 2004. - Vol. 11, № 3. - P. 169 -183.
66. Pissuwan D. Therapeutic possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles / D. Pissuwan, S. M. Valenzuela, M. B. Cortie // Trends Biotechnol. - 2006. - Vol. 24, № 2. - P. 62 -67.
67. Synthesis and bioconjugation of gold nanoparticles as potential molecular probes for light-based imaging techniques / R. G. Rayavarapu, W. Petersen,
68. C. Ungureanu [et al.] // Int. J. Biomed. Imaging. - 2007. - Vol. 2007, ArticleID 29817. - 10 p.
69. Reznichenko L. S. The peculiarities of proteins interaction with gold and silver nanoparticles of different sizes / L. S. Reznichenko, T. G. Gruzina, Z. R. Ulberg // Abstracts of Ukrainian-German Symposium on Physics and Chemistry of Nanostructures and on Nanobiotechnology (September 6 -10, 2010, Beregove, The Crimea, Ukraine). - P. 219.
70. Rout M. P. The nuclear pore complex as a transport machine / M. P. Rout, J. D. Aitchison // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, № 20. - P. 16593 - 16596.
71. Samarasinghe S. R. Synthesis, processing and forming gold structures from a 0,1 wt. % concentration solution / S. R. Samarasinghe, M. J. Edirisinghe // Gold Bulletin. - 2008. - Vol. 41, № 4. - P. 284 -295.
72. Size controlled synthesis of gold nanoparticles using photochemically prepared seed particles / T. K. Sau, A. Pal, N. R. Jana [et al.] // J. Nanopart. Res. - 2001. - № 3. - P. 257 -261.
73. Schneider E. All three subunits are required for the reconstitution of an active proton channel (F₀) of Escherichia coli ATP synthase (F₁F₀) / E. Schneider, K. Altendorf // The EMBO Journal. - 1985. - № 4. - P. 515 -518.
74. Semenza G. L. Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxiz-inducible factor 1 / G. L. Semenza // J. Biol. Chem. - 1996. -№ 271. - P. 32529-32537.
75. Semenza G. L. Tumor metabolism: cancer cells give and take lactate / G. L. Semenza // J. Clin. Invest. - 2008. - Vol. 118, № 12. - P. 3835-3837.
76. Inhibition of Cytochrome P450 Enzymes by metallic nanoparticles: a preliminary to nanogenomics / A. Sereemaspun, P. Hongpiticharoen, R. Royanathanes [et al.] // Int. J. Pharm. - 2008. - Vol. 4, № 6. - P. 492-495.
77. Thomas M. Conjugation to gold nanoparticles enhances polyethylenimine's transfer of plasmid DNA into mammalian cells / M. Thomas, M. Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2003. - Vol. 100, № 16. - P. 9138-9143.
78. Topuria I. Statistical analysis of some biochemical parameters of aggressive non-hodgkin lymphomas / I. Topuria // Ann. Biomed. Res. Educ. - 2002. -Vol. 2, № 1. - P. 84-86.
79. Ulberg Z. R. Interaction of energized bacteria cells with particles of colloidal gold: peculiarities of the process / Z. R. Ulberg, A. S. Dukhin, V. I. Karamushka // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1134 - P. 89-95.
80. Ulberg Z. R. ATР - Dependent gold accumulation by living chlorella cells / Z. R. Ulberg, V. I. Karamushka, A. S. Dukhin // Acta Biotech. - 1991. -Vol. 11, № 3 - P. 197-203.
81. Vlerken L. E. Multi-functional polymeric nanoparticles for tumor-targeted drug delivery / L. E. Vlerken, M. M. Amiji // Expert. Opin. Drug Deliv. - 2006. -Vol. 3, № 2. - P. 205-216.
82. Weyermann J. A practical note on the use of cytotoxicity assays / J. Weyermann, D. Lochmann, A. Zimmer // Int. J. Pharm. - 2005. - № 288. - P. 369-376.
83. Whyman R. Gold nanoparticles a renaissance in gold chemistry / R. Whyman // Gold Bulletin. - 1996. - Vol. 29, № 1. - P. 11-15.
84. Zhang Y. X. Mesoscale spherical and planar organizations of gold nanoparticles / Y. X. Zhang, H. C. Zeng // Funct. Mater. Lett. - 2008. - Vol. 1, № 1. -P. 43-53.