Біомембрана: наноструктура та вплив наночастинок

Ключовим елементом існування клітини є біомембрана - комплексна структура, що оточує клітину, визначає її межі та відділяє цитозоль від зовнішнього середовища, а вміст органел - від цитозолю. Біомембрана представлена тонкою плівкою товщиною, в середньому, 5 нм, яка складається з ліпідних та білкових молекул, з'єднаних, переважно, за допомогою нековалентних зв'язків. Клітинна мембрана - це динамічна, плинна структура; більшість її молекул здатна дифун-дувати вздовж мембрани. Ліпідні молекули розташовані у вигляді подвійного шару (бішару), який надає мембрані плинних властивостей та виступає у ролі майже непроникного бар'єру для багатьох розчинних у воді сполук. Багато важливих функцій виконують білки, що, пронизуючи ліпідний бішар, транспортують через мембрану специфічні молекули чи прискорюють мембраноасоційовані реакції, такі як синтез АТФ. Деякі протеїни виступають у ролі структурних ланок, що зв'язують цитоскелет (волокнисту актинову коміркову структуру, зв'язану з цитозольною поверхнею біомембрани [25]) через ліпідний бішар із зовнішньоклітинною матрицею чи іншою клітиною, тоді як інші є біосенсорами, що приймають та передають хімічні сигнали в клітинне середовище [1]. Біомембрани мають у основі наноструктурні домени - елементи, вивчення яких стало можливим завдяки створенню нових методів дослідження та сучасної апаратури з високою роздільною здатністю. Задачею нанотоксикології та нанотехнологій, на сьогодні, є з'ясування та дослідження закономірностей впливу наночастинок на структуру й функції біомембрани. Адже знання з даного аспекту допомагає не тільки досліджувати лікувальні й токсикологічні властивості наноматеріалів, але й також знаходити нові сфери їх медичного застосування.

Нанорозмірні комірки та аномальна дифузія - еволюція поглядів на структуру біомембрани.

У 1972 році Singer S. J. та Nicolson G. L., спираючись на результати термодинамічних досліджень, запропонували розглядати біомембрану як двовимірну рідину, упорядковану за принципами рідинно-мозаїчної моделі. Відповідно до цієї гіпотези, мембрана - це орієнтований, двовимірний, в'язкий розчин амфіфільних протеїнів та ліпідів, що перебувають у термодинамічній рівновазі [50].

Погляди на структуру біомембрани змінюються та еволюціонують із розвитком нових технологій дослідження мікро- та наноструктур. Традиційна рідинно-мозаїчна модель передбачає існування протеїнів у біомембрані в площині, перпендикулярній до поверхні клітини. На сьогодні відомо, що білки можуть мати великі за розміром ектодомени - ділянки, які виступають над поверхнею мембрани в зовнішньоклітинний простір та створюють об'ємні перешкоди. Останні дослідження також показали, що товщина біомембрани не є однаковою по всій довжині. Плинність ліпідів та відносно мала рухливість протеїнів є підставою для висновку, що ліпідний компонент скривлюється для "маскування" гідрофобних ділянок протеїнів, розташованих над поверхнею мембрани. Однак у окремих випадках може спостерігатись також скривлення й протеїнів. Комплексність та складність структур узагальнена Engelman D. M. (2005), який запро-понував розглядати біомембрану як систему з фрагментарним упорядкуванням олігомерних протеїнів[11].

У вивченні динаміки, структури та функції клітинної мембрани набувають все більшого значення новітні експериментальні технології, що дозволяють вченим відстежувати окремі молекули чи групи молекул. Ці технології надають дослідникам можливість спостерігати пересування, агрегацію та, навіть, активацію індивідуальних молекул у плазматичній мембрані живої клітини. У методі флюоресцентного відстеження окремих молекул (ФВОМ) флюоресцентний зонд (молекула протеїну) зв'язується із заданою експериментаторами сполукою-мішенню. Результат реєструється засобами флюоресцентної мікроскопії. У методі відстеження окремих частинок (ВОЧ), наночастинки золота діаметром 20-40 нм зв'язуються з певними молекулами для відстеження руху останніх у мембрані за допомогою диференціальної інтерференційно-контрастної мікроскопії (мікроскопії Номарського) чи мікроскопії методом світлого поля [23, 41].

Хоча більшість мембран характеризуються високою плинністю, останні дослідження за допомогою методу ВОЧ виявили комплекс обмежень латеральної рухливості протеїнів [11, 24]. Причинами обмеження є утворення великих олігомерів, зіткнення ектодоменів протеїнів, взаємодії різної природи в бішарі, існування ділянок адгезії та особливості цитоскелетної структури клітини [8].

Існують дві проблеми-запитання, на які двовимірна рідинно-мозаїчна модель біомембрани не може дати відповіді. По-перше, чому коефіцієнти дифузії для протеїнів та ліпідів у плазматичній мембрані менші, ніж у штучній мембрані чи у ліпосомах, у 5-50 разів. По-друге, чому олігомери чи молекулярні комплекси дифундують значно повільніше, порівняно із одиничними мономерами. Створення нової моделі структури біомембрани стало необхідним кроком у розумінні природи даних феноменів [23].

Згідно з результатами досліджень ВОЧ, дифузія компонентів біомембрани не підпорядковується закону броунівського руху - спостерігається так звана стрибкоподібна (аномальна) дифузія. Плазматична мембрана поділена на нанокомірки мінімальною довжиною 10 нм (останні дослідження показали, що в природі розміри комірок біомембран залежно від типу живих клітин варіюють від 30 до 250 нм [25]). Всередині комірок дифузія молекул не обмежена перешкодами. Щоб перейти з однієї комірки в іншу, молекулі необхідно здійснити "стрибок", що вимагає витрат часу та енергії [24].

Для пояснення принципів аномальної дифузії були запропоновані дві моделі мембранних структур:1) модель мембранного актинового цитоскелетного паркану (МАЦП);2) модель стовпів із закріплених трансмембранних протеїнів (СЗТП) [24, 41].

На базі даних ВОЧ, із використанням технології оптичного пінцету та клітин із модифікованими цитоскелетом й цитоплазматичними доменами трансмембранних протеїнів, сформована модель МАЦП, згідно з якою цитозольні домени протеїнів стикаються з цитоскелетом, призводячи до тимчасового обмеження руху в цитоскелетній нанокомірці. Трансмембранні білки здатні перестрибувати з однієї комірки в іншу, коли між мембраною та цитоскелетом утворюється достатній простір для проходження цитозольної частини протеїну. Цей простір формується у результаті температурних коливань, коли актинові філаменти цитоскелету тимчасово дисоціюють, а трансмембранний протеїн, відповідно, має достатню кінетичну енергію для подолання бар'єру. Результати спостережень з використанням атомно-силової мікроскопії з тривимірною реконструкцією зображення за допомогою комп'ютерної томографії підтвердили вірність моделі МАЦП [24].

Невирішеним залишалось питання, як обмеження у русі може поширюватися на фосфоліпіди в зовнішньому моношарі мембрани - за умов відсутності прямого контакту з цитоскелетом. Для пояснення була запропонована модель СЗТП. Деякі трансмембранні протеїни (за даними Kusumi A. et al. (2010) - біля 15% від загальної кількості [25]) закріплені в цитоскелеті та відіграють роль "стовпів", що обмежують рух ліпідів у бішарі [41]. Цікавим є факт, що протеїни не обов'язково мають бути з'єднані з актиновими філаментами протягом тривалого часу. Враховуючи, що молекула перетинає комірку у 10 нм у середньому за 10 мс, трансмембранний білок може виконувати роль "стовпа" протягом цього короткого проміжку часу, що є достатньою умовою [24].

Для мономерів молекул біомембрани дифузія між нанокомірками проходить відносно легко, тоді як для великих молекулярних комплексів необхідною умовою переходу є здійснення "стрибку" всіма компонентами одночасно. З цієї причини швидкість перемщення останніх між комірками є більш низькою. Крім того, олігомери часто зв'язуються з елементами цитоскелету, що спричинює тимчасову іммобілізацію комплексів. Даний ефект обмеження дифузії отримав назву олігомеризаційно-індукованої пастки (ОІП). У відповідь на дію зовнішньо-клітинного фактору рецептор формує олігомерний комплекс, що, завдяки ефекту ОІП, залишається у комірці, де був отриманий сигнал. Таке обмеження у просторі надзвичайно важливе для сигналів, що викликають локальну реорганізацію цитоскелету чи хемотаксичні ефекти [25, 41].

Нанорозмірні мембранні домени. Гіпотеза ліпідних рафтів.

Більшість ліпідів біомембрани знаходиться у невпорядкованому, мозаїчному стані. Сили Вандер-Ваальса між сусідніми "хвостами" жирних кислот є недостатньо вибірковими для утримання молекул одного типу разом. Однак для сфінголіпідів, що мають довгі та насичені вуглеводневі ланцюги, сили притягання є достатні-ми для концентрування сполук у малих доменах, що отримали назву "ліпідні рафти" й розглядаються як локальні ділянки фазового переходу - місця, у яких дещо втрачаються властивості мембрани як рідини [37, 48]. Поштовхом до роз-глядання проблеми існування ліпідних рафтів стали дослідження з утворення у модельних мембранах впорядкованих (l ) та плинних (ld) фаз під впливом холестерину на фосфоліпіди. Дійсно, холестерин впорядковує ацильні ланцюги ліпідів, що призводить до утворення фази l [32]. Процесу упорядкування особливо сприяють сфінголіпіди, що мають лінійні насичені ацильні ланцюги та здатні утворювати міжмолекулярні водневі зв'язки. Проведені на модельних мембранах експерименти підтверджували динамічне існування двох фаз [47], що лягло в основу "гіпотези рафтів" [33].

Відомо, що біомембранам властива гетерогенність, яка пояснюється просторовим обмеженням білків та ліпідів у нанорозмірних ділянках [30]. Зміна рухливості та тимчасове скупчення молекул у цих доменах може мати прямий вплив на здатність мембрани виконувати біологічні функції та забезпечувати можливість здійснення таких клітинних процесів, як збудливість, презентація антигенів та міжклітинні взаємодії. Передбачуваний розмір цих мембранних доменів варіює від декількох одиниць до сотень нанометрів.Згідно із запропонованою Koopman М. (2006) моделлю мембрани, частина молекул впорядковано розташована в окремих нанорозмірних доменах, що функціонують у ролі "мембранних організаторів", які підтримують та приско-рюють утворення функціональних доменів більших розмірів у відповідь на дію зовнішніх чи внутрішніх чинників [20]. При цьому нанорозмірні ліпідні домени розглядаються як прекурсори рафтів [31]. Відкриття нанодоменів стало можливим завдяки використанню скануючої ближньопольової оптичної мікроскопії [20]. Ліпідні рафти більш щільні, ніж інші ділянки бішару, та є місцем накопичення певних мембранних білків, що уможливлює їх функціонування у комплексі для перетворення сигналів зовнішнього середовища у внутрішньоклітинну відповідь, а також для участі в процесах екзо- та ендоцитозу, клітинної адгезії та мембранного транспорту. Ліпіди одного моношару рухаються незалежно від ліпідів іншого. Однак у рафтах молекули перемщуються узгоджено в обох моношарах завдяки взаємодії протилежно розташованих вуглеводневих ланцюгів сфінголіпідів [15, 37, 45, 49]. Koopman М. (2006) запропонована модель організації клітинної мембрани, у якій у неактивному стані малі ліпідні (рафтові) та протеїнові домени співіснують з окремими мономерами. При активації (під дією подразнюючого фактора) формуються більші протеїнові домени, стабілізовані лі-підними рафтами [20].Плазматична мембрана тваринних клітин містить велику кількість багатих на сфінголіпіди та холестерин ліпідних рафтів [29], розмір яких залишається предметом дискусій: деякі автори вважають його рівним 15-44 нм [37], інші -30-250 нм [25]. Причиною цього є відсутність серед вчених світу загальноприйнятих єдиних методів дослідження рафтів та загальних визначень [9]. Відкритим залишається питання, що саме називати рафтами - "мембранні організатори" чи більші активовані функціональні домени, а також, чи існують ліпідні рафти в неактивному стані [20].

Біологічні наноканали та нанофлюїдика.

У нормі ліпідний бішар проникний лише для незаряджених неполярних молекул малого розміру. Проходженню гід-рофільних та заряджених молекул перешкоджає гідрофобний, діелектричний бар'єр. Біомембрана виступає у ролі електричного ізолятору. Транспортування іонів через мембрану забезпечують іонні канали - спеціалізовані трансмембранні протеїни [28, 57]. Деякі з цих каналів, так звані "канали витоку", дозволяють іонам переміщуватися у клітину чи з неї за градієнтом концентрації; інші відіграють більш активну роль та діють як ворітний механізм, що контролює іонні потоки. Протеїни іонних каналів створюють у біомембрані пори, що уможлив-лює рух іонів у відповідь на різноманітні подразники, серед яких - дія хімічних лігандів, зміни мембранного потенціалу, температури та чинники механічного впливу. Зміни в іонному розподілі можуть, у свою чергу, спричиняти зміни в мембранному потенціалі та, у випадку іонів кальцію, безпосередньо активувати різні внутрішньоклітинні сигнальні каскади. Генеровані іонними каналами сиг-нали є одними з найшвидших серед зареєстрованих у біосистемах. Іонний потік крізь пору може досягати значень 10⁹ іон/с [5].

Існують дві основні групи ворітних каналів - потенціал-залежні (ПЗК) та ліганд-залежні (ЛЗК). При мембранному потенціалі спокою канали повністю зачинені та непроникні для потоку іонів. Тим не менш, при зміні мембранного потенціалу (для ПЗК), взаємодії з певною сполукою (для ЛЗК) чи під дією іншого фактору, канал може відкритися [28].

Біологічні іонні канали - це наповнені водою нанорозмірні пори, сформовані молекулами протеїнів у біомембрані. Просторове обмеження рідини в нанопорі призводить до появи нових властивостей, адже розміри пор наближаються до типових молекулярних величин та довжини Дебая - відстані, на яку поширюється дія електричного поля окремого заряду в нейтральному середовищі, що складається з позитивно та негативно заряджених частинок. Довжина Дебая залежить від концентрації заряджених часток, діелектричної сталої та абсолютної температури. Феномен зміни властивостей рідини в нанорозмірних каналах є об'єктом великого наукового інтересу, адже лежить у основі біологічних процесів, що відбуваються у природних наноканалах біомембрани [22]. Дослідження даного феномену - задача нанофлюїдики - нової науки, що вивчає властивості рідин у нанорозмірних структурах [3, 12]. Докладне вивчення цих властивостей допомо-же зрозуміти наноприроду процесів клітинного гомеостазу та передачі сигналів у нервовій та м'язовій тканинах, що регулюються іонними наноканалами [12].

Нанофлюїдика досліджує феномени в нанорозмірних рідинних системах. Серед них найбільш важливі:

• Феномен поверхневої енергії. У макросистемах з ламінарним потоком рідини прийнято вважати, що швидкість потоку граничного шару рідини дорівнює нулю. У наноканалах опір рідини біля поверхні зменшується, внаслідок чого спостерігається "ефект ковзання" - рідина має відмінну від нуля швидкість переміщення. Ковзання найбільш характерне для рідин біля гідрофобних жорстких поверхонь. Також проявом феномену є створення від'ємного тиску рідини в наноканалі [34, 54].
• Феномен зсуву. Зростання сил зсуву в нанорозмірній рідині уможливлює розтягування та фрагментацію молекул полімерів, що використовується у діагностичних та інших дослідних цілях [10].
• Феномен надгідрофобності, або "лотос-ефект". Виникненню "надгідрофобних" властивостей сприяє значна шорсткість поверхні наноканалів. У природі цей ефект можна спостерігати, коли краплі дощу скочуються по гідрофобній поверхні листка лотосу, очищуючи його від мікроорганіз-мів та частинок пилу [10].
• Феномен електричного подвійного шару. Внаслідок наближення значення радіусу наноканалів до довжини Дебая, у останніх спостерігається явище накладання електричних подвійних шарів поверхонь. Це призводить до значного зростання електропровідності каналу. Іони, що мають однойменний з внутрішньою поверхнею каналу заряд, будуть видалені з нього. Наноканал натомість буде заповнений іонами протилежного заряду - контріонами. Наслідком накладання електричних подвійних шарів та підвищення концентрації контріонів є зростання осмотичного та гідростатичного тиску в наноканалах. У нирках цей феномен лежить у основі напівпроникності базальної мембрани нефронів - не дозволяє негативно зарядженим молекулам альбуміну переходити з крові в первинну сечу, бо базальна мембрана нефрону несе негативний заряд. Феномен електричного подвійного шару знайшов практичне використання у синтетичних мембранах, заряд поверхні яких може штучно змінюватись протягом експерименту, що дозволяє застосовувати пристрої як нанофільтри [46].
• Феномен розміру. Розмір молекул та об'ємні сили відштовхування на нанорозмірному рівні спричинюють виникнення ефекту ексклюзії - різної здатності речовин проникати в пори носія. Феномен покладено в основу розділення сполук методом ексклюзійної хроматографії. У природі ефект ексклюзії відіграє роль у функціонуванні аквапоринів - водних наноканалів, що транспортують воду, але є непроникними для високомолекулярних сполук та електролтв (для проходження через наноканал електролітам необхідно було б позбутися власної водної оболонки, що є енергетично невигідним). Завдяки водневим зв'язкам, молекули води проходять через вузький просвіт каналу у вигляді неперервного потоку товщиною у одну молекулу [6].
• Феномен молекулярної структури. Врахування взаємодій на рівні окремих молекул системи є надзвичайно важливим для нанофлюїдики. На-приклад, для аквапоринів ще однією причиною непроникності для заряджених часток, зокрема протонів, є існування ароматично-аргінінового селективного фільтру - позитивно заряджений аргінін не дозволяє протонам надходити в наноканал [7].
• Феномен ентропії. Природні системи прагнуть до збільшення ймовірних станів - збільшення ентропії. Наприклад, ДНК має значно більше ймовірних станів у згорнутому положенні, ніж у розгорнутому. Тому для збільшення ентропії, молекула буде ймовірніше займати великі порожнини поверхні, а не заповнювати малі. Цей феномен знайшов застосування у "пастках ентропії", що використовуються для розділення молекул ДНК за довжиною [53].

На сьогодні нанофлюїдика знаходить біотехнологічне застосування у створенні "лабораторій на чипі" - високочутливих аналітичних засобів, що здатні ізолювати та досліджувати окремі макромолекули [3]. Практичне застосування знайшов перемикач іонних каналів - біосенсор, що містить іонні канали граміцидину А. Граміцидиновий канал, що містить пору діаметром 0,4 нм та довжиною 2,8 нм, хаотично перемщується у ліпідній мембрані, отже виступає у ролі динамічного нанобіосенсору. Перемикач іонних каналів забезпечує швидке виявлення низько- та високомолекулярних сполук. Сигналом, при виявленні аналізу, є реакція зі специфічними антитілами, що перекривають транспорт іонів, чи "молекулярними пробками", які блокують канальну пору. Перемикач іонних каналів застосовується у діагностиці, зокрема - для швидкого виявлення вірусу грипу А у біологічному матеріалі [22]. Для імітації процесів іонного транспорту в біомембранах розроблені штучні наноканали, що дозволило пришвидшити розвиток наномашин-біосенсорів та засобів нанофлюїдики. Ідеальним вибором для досліджень з нанофлюїдики стали вуглецеві нанотрубки, що хімічно інертні та мають просту структуру; крім цього, довжина й діаметр нанотрубок можуть біти легко модифіковані. Вибірковість іонного транспорту в штучних наноканалах регулюється змінами температури та рН [12, 17].

Вплив наночастинок на структуру та функції біомембрани.

Здобуття глибоких та всебічних знань у сфері взаємодії наночастинок з біологічними системами, зокрема з біомембраною, є головним завданням у визначенні лікувальних та ток-сикологічних властивостей наночастинок та напрямків їх потенційного застосування як медикаментів та засобів доставки біологічно активних речовин [27].

Зацікавленість вчених цим питанням підтверджується побудовою комп'ютерних моделей [13, 38] та проведенням експериментальних досліджень [42, 43] з вивчення різних аспектів взаємодії компонентів біомембрани та наночастинок (НЧ); зокрема велику увагу приділено гідрофобному ефекту НЧ. Зокрема, Hong S. et al. (2004) визначили, що незаряджені ("гідрофобні") дендримери абсорбуються ліпідним бішаром, тоді як заряджені - спричинюють виникнення отворів у мембрані. Дендримери з кінцевими первинними аміногрупами в нейтральному середовищі протонуються, утворюючи катіонний полімер. Такі структури можуть вступати в електростатичну взаємодію з біомембраною, у результаті чого в останній утворюються отвори діаметром 15-40 нм, порушується цілісність. Чим більшу кількість первинних аміногруп містить дендример, тим вища густина заряду його поверхні, а отже - сильніший руйнівний вплив на біомембрану. Після видалення розчину дендримерів мембранна структура протягом 2 годин може відновитися завдяки процесам ауторепарації. Але, у концентраціях більше 500 нМ дендримери-полікатіони спричинюють достатньо ма-сивну дендропорацію (утворення отворів), що призводить до загибелі клітини. Дендримери з термінальними ацетамідними групами не формують отворів, бо не утворюють зарядженого полімеру. Для проникнення у клітину такі дендримери необхідно функціоналізувати залишком фолієвої кислоти для їх взаємодії з фолат-рецепторами на поверхні мембрани та надходження шляхом ендоцитозу в клітину [16, 26].

Qiao R. et al. (2007) проведені дослідження з впливу гідрофобності фулеренів на їх поведінку в біомембрані. Тоді як гідрофобний нефункціоналізований "первинний" С60 фулерен може проникати крізь бішар, його гідрофільні похідні здатні лише адсорбуватися на поверхні. Первинний фулерен при проникненні в мембрану збільшує відстань між "голівками" ліпідів у місці проходження. Це надає більшим за розмірами молекулам можливість проникати в клітину та порушувати цілісність мембрани. Опосередкований механічний вплив на проникність мембрани доповнюється біохімічним механізмом ушкодження - фулерени здатні спричинювати запуск процесів перекисного окиснення ліпідів. Гідрофільні похідні С6₀ сприяють ущільненню "голівок" ліпідів, що пояснює їх низьку токсичність порівняно з первинним фулереном [38]. Дослідження Kraszewski S. et al. (2010) показали, що первинні фулерени здатні зв'язуватися з різними ділян-ками калієвих каналів біомембрани та спричиняти розвиток токсичних ефектів, діючи як блокатори чи модулятори [21].

Li Y. et al. (2008) продемонстрували механізм взаємодії НЧ різної гідрофобності з біомембраною за допомогою методів "крупнозернистої" молекулярної динаміки. В експерименті використані гідрофобні та напівгідрофільні частинки діаметром 10 нм. Для визначення можливості проникнення частинок крізь мембрану були обчислені профілі вільної енергії. Також були досліджені флуктуаційні ефекти як відображення впливу НЧ на структуру й цілісність мембрани. У досліді з гідрофобною НЧ остання послідовно проникала в мембрану, розсовуючи ліпіди та повністю заповнюючи проміжок між ними, та зупинилась у центральній ділянці бішару. Протягом всього експерименту жодна молекула води не проходила крізь ліпідний бішар, що свідчить про збереження мембранної цілісності. Отже, мембрана стає більш щільною, але нових отворів не утворюється. У випадку напівгідрофільної НЧ остання лише адсорбувалася на поверхні бішару [27]. Ці результати підтверджені в експерименті, де НЧ золота, вкриті гідрофільною оболонкою, не проникали шляхом пасивного транспорту через фосфоліпідні мембрани [2]. Тим не менш, експерименти свідчать, що НЧ можуть потрапляти в клітину шляхом ендоцитозу з формуванням ліпідної транспортної везикули [40].

Важливу роль у взаємодії з біомембраною, поряд з гідрофобним ефектом, ві-діграє розмір частинок. Roiter Y. et al. (2008) провели дослідження впливу на ліпідний бішар полярних НЧ кремнію різних розмірів. Згідно отриманих результатів, частинки розміром менше 1,2 нм не впливали на структуру мембрани. НЧ 1,2-22 нм утворювали пори в бішарі. Цей факт пояснювався тим, що присутність гідрофільних НЧ у біомембрані є термодинамічно невигідною. Щоб ізолювати гідрофобний компонент від полярної частинки бішар був вимушений утворювати пори. Також виявилося, що вплив НЧ на мембрану залежить від кривизни поверхні нанооб'єктів. Існує критичний розмір частинок, що дорівнює 22 нм для мембрани товщиною 5 нм, при перевищенні якого співвідношення енергії адгезії та пружної деформації ліпідного бішару зумовлює "обгортання" НЧ мембраною [42, 43].

При адсорбції на поверхні чи проникненні у мембрану НЧ можуть змінювати її поверхневий натяг та інші властивості, що, у свою чергу, може вплинути на функції біомембрани, наприклад, на поділ клітин [27].

Увагу наукового світу на сьогодні привертають нанометали - антибактеріальні лікарські засоби нового покоління. Важливим є дослідження впливу цих наноматеріалів на прокаріотичні біомембрани - для встановлення механізму протимікробної дії та еукаріотичні біомембрани - з метою дослідження та оцінки токсичності. Одним з найбільш перспективних антибактеріальних агентів є наносрібло. Достеменний механізм протимікробної дії НЧ срібла досі не відомий. Нанорозмірні частинки в розчині здатні вивільняти деяку кількість іонів, з чим може бути пов'язана біологічна дія [36].

Завдяки дисоціації великої кількості карбоксильних та фосфатних функ-ціональних груп мембрани при фізіологічних значеннях рН, поверхня бактеріальних та спорових клітин негативно заряджена. Протилежні заряди бактерії та НЧ зумовлюють накопичення останніх на поверхні мембрани внаслідок електро-статичних взаємодій [52]. Але, електростатичні явища не у всіх випадках відіграють ключову роль у адгезії частинок на поверхні біомембрани, адже активні НЧ можуть бути заряджені негативно та все одно взаємодіяти з біомембраною [18]. Цікавими є дослідження Wang B. et al. (2008), результати яких допомагають встановити зв'язок між видом заряду НЧ та локальними змінами в щіль-ності фосфоліпідів біомембрани. Цей феномен був досліджений при дії частинок на "голівки" фосфатидилхоліну (ФХ) у мембрані, що закінчуються електричним диполем Р ^- -N⁺. Аніонні НЧ взаємодіяли з N⁺, спричинюючи місцеве підвищення щільності ліпідів, тоді як позитивно заряджені НЧ взаємодіяли з Р -, зменшуючи щільність. Таким чином, заряджені НЧ сприяли виникненню ділянок локального фазового переходу в біомембрані [56].НЧ срібла після адгезії на поверхні біомембрани зв'язуються з сірковмісни-ми та іншими протеїнами мембрани, призводячи до їх денатурації [35, 39]. Порушення морфології мембрани під дією срібла може спричинити значне підвищення проникності, призводячи до неконтрольованого транспорту сполук через мембрану і, в кінці кінців, до смерті клітини [35, 36]. Аналіз за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) дозволив довести факт утворення частинками наносрібла "пор" у біомембрані [51]. Взаємодіючи з протеїнами мембрани, НЧ срібла порушують функціонування дихального ланцюга бактерії [4, 36, 39], а також, внаслідок інактивації антиоксидантних ферментів, запускають утворення вільних радикалів та наступне перекисне ушкодження мембрани [18].

На стовбурових клітинах мишей досліджені токсичні властивості НЧ срі-бла. Результати показали, що в еукаріотичній клітині наносрібло має більший токсичний вплив на метаболічні процеси, менший - на біомембрану [4]. "Чисті" НЧ срібла більш токсичні для еукаріотичних клітин, ніж функціоналізовані (нанорозмірні частинки тіопронін-срібло; вкриті шаром бичачого сироваткового альбуміну НЧ сплаву срібло-платина; НЧ срібла, захищені натрію поліглутаматом). Це підтверджує гіпотезу, що токсичність частинок пов'язана з присутністю відкритих металічних поверхонь, тоді як захищені органічним шаром частинки менш токсичні. Виключення становлять лише НЧ срібла, функціоналізовані крохмалем, що призводять до порушення функцій мітохондрій, індукції процесів перекисного окиснення ліпідів, ушкодження ДНК та зупинки клітинного циклу [19]. Вплив хімічних властивостей поверхні на токсичність НЧ також досліджу-вали Wagner A. J. et al. (2007). В експерименті застосовані частинки алюмінію та алюмінію оксиду однакових розмірів. Результати показали, що алюміній виявив значно більшу токсичність порівняно з оксидом. Автори дійшли до висновку, що цитотоксичність НЧ алюмінію напряму залежить від хімічної будови частинок -покриття поверхні частинок киснем оксидів зменшувало токсичні ефекти [55].

Деякі автори вважають, що НЧ срібла не мають прямого впливу на протеїни біомембрани. Той факт, що антибактеріальна активність наноструктурованого срібла перевищує активність срібла нітрату пояснюється здатністю наносрібла поступово та протягом тривалого часу постійно вивільняти іони срібла в серед-вище [14, 44].

Отже, НЧ можуть впливати на такі властивості ліпідного бішару, як цілісність, поверхневий натяг та локальна щільність ліпідів. Але й мембрана, як складна комплексна структура, здатна завдяки природним засобам ауторепара-ції самостійно адаптуватися до зовнішнього впливу [27].

ЛІТЕРАТУРА

1. Engelman D. M. Membranes are more mosaic than fluid / D. M. Engelman // Nature. - 2005. - Vol. 438, № 7068. - P. 578-580.
2. pH-tunable ion selectivity in carbon nanotube pores / F. Fornasiero, J. B. In, S. Kim [et al.] // Langmuir. - 2010. - Vol. 26, № 18. - P. 14848-14853.
3. Ginzburg V. V. Modeling the thermodynamics of the interaction of nanoparticles with cell membranes / V. V. Ginzburg, S. Balijepalli // Nano Lett. - 2007. -Vol. 7, № 12. - P. 3716-3722.
4. Green fluorescent protein-expressing Escherichia coli as a model system for investigating the antimicrobial activities of silver nanoparticles / S. K. Gogoi, P. Gopinath, A. Paul [et al.] // Langmuir. - 2006. - Vol. 22, № 22. -P. 9322-9328.
5. Helms J. B. Lipids as targeting signals: lipid rafts and intracellular trafficking / J. B. Helms, C. Zurzolo // Traffic. - 2004. - Vol. 5, № 4. - P. 247-254.
6. Interaction of poly(amidoamine) dendrimers with supported lipid bilayers and cells: hole formation and the relation to transport / S. Hong, A. U. Bielinska, A. Mecke [et al.] // Bioconjug. Chem. - 2004. - Vol. 15, № 4. - P. 774-782.
7. A biomimetic asymmetric responsive single nanochannel / X. Hou, F. Yang, L. Li [et al.] // J. Am. Chem. Soc. - 2010. - Vol. 132, № 33. - P. 11736-11742.
8. Antimicrobial effects of silver nanoparticles / J. S. Kim, E. Kuk, K. N. Yu [et al.] // Nanomedicine. - 2007. - Vol. 3, № 1. - P. 95-101.
9. Silver nanoparticles / [Klippstein R., Fernandez-Montesinos R., Castillo P.M. et al.]. - Vienna: IN-TECH Books, 2010. - P. 309-324.
10. Koopman M. Nanoscale cell membrane organization: a near-field optical view / Koopman M. - Enschede: University of Twente, 2006. - 142 p.
11. Affinity of C60 neat fullerenes with membrane proteins: a computational study on potassium channels / S. Kraszewski, M. Tarek, W. Treptow [et al.] // ACS Nano. - 2010. - Vol. 4, № 7. - P. 4158-4164.
12. Krishnamurthy V. Ion channel biosensors - part I: construction, operation, and clinical studies / V. Krishnamurthy, S. Monfared, B. Cornell // IEEE Transactions on Nanotechnology. - 2010. - Vol. 9, № 3. - P. 313-322.
13. Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules / A. Kusumi, H. Ike, C. Nakada [et al.] // Semin. Immunol. - 2005. - Vol. 17, № 1. - P. 3-21.
14. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules / A. Kusumi, C. Nakada, K. Ritchie [et al.] // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. - 2005. - Vol. 34. - P. 351-378.
15. Hierarchical organization of the plasma membrane: investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy / A. Kusumi, Y. M. Shirai, I. Koyama-Honda [et al.] // FEBS Lett. - 2010. - Vol. 584, № 9. -P. 1814-1823.
16. Nanoparticle interaction with biological membranes: does nanotechnology present a Janus face? / P. R. Leroueil, S. Hong, A. Mecke [et al.] // Acc. Chem. Res. -2007. - Vol. 40, № 5. - P. 335-342.
17. Li Y. Computational investigation of interaction between nanoparticles and membranes: hydrophobic/hydrophilic effect / Y. Li, X. Chen, N. Gu // J. Phys. Chem. B. - 2008. - Vol. 112, № 51. - P. 16647-16653.
18. Li-Fries J. Ion channels in mixed tethered Bilayer lipid membranes / J. Li-Fries // Johannes Gutenberg-Universität Mainz, 2007. - 140 p.
19. Amyloid oligomer neurotoxicity, calcium dysregulation, and lipid rafts / F. Malchiodi-Albedi, S. Paradisi, A. Matteucci [et al.] // Int. J. Alzheimers Dis. - 2011. - Vol. 2011, № 906964. - P. 1 -17.
20. Maxfield F. R. Plasma membrane microdomains / F. R. Maxfield // Curr. Opin. Cell. Biol. - 2002. - Vol. 14, № 4. - P. 483 -487.
21. Mayor S. Rafts: scale-dependent, active lipid organization at the cell surface / S. Mayor, M. Rao // Traffic. - 2004. - Vol. 5, № 4. - P. 231 -240.
22. Acyl-chain methyl distributions of liquid-ordered and -disordered membranes / M. Mihailescu, R. G. Vaswani, E. Jardón-Valadez [et al.] // Biophys. J. - 2011. - Vol. 100, № 6. - P. 1455 -1462.
23. Neumann A. K. Understanding lipid rafts and other related membrane domains / A. K. Neumann, M. S. Itano, K. Jacobson // F1000 Biol Rep. - 2010. - Vol. 2, № 31. - P. 1 -5.
24. Microfluidics and complex fluids / P. Nghe, E. Terriac, M. Schneider [et al.] // Lab. Chip. - 2011. - Vol. 11, № 5. - P. 788 -794.
25. Pal S. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli / S. Pal, Y. K. Tak, J. M. Song // Appl. Environ. Microbiol. - 2007. - Vol. 73, № 6. - P. 1712 -1720.
26. The bactericidal potential of silver nanoparticles / E. Parameswari, C. Udayasoorian, S. P. Sebastian [et al.] // International Research Journal of Biotechnology. - 2010. - Vol. 1, № 3. - P. 44 -49.
27. Parton R. G. Lipid rafts and plasma membrane microorganization: insights from Ras / R. G. Parton, J. F. Hancock // Trends Cell. Biol. - 2004. - Vol. 14, № 3. - P. 141 -147.
28. Translocation of C60 and its derivatives across a lipid bilayer / R. Qiao, A. P. Roberts, A. S. Mount [et al.] // Nano Lett. - 2007. - Vol. 7, № 3. - P. 614 -619.
29. Antibacterial characterization of silver nanoparticles against E. coli ATCC-15224 / M. Raffi, F. Hussain, T. M. Bhatti [et al.] // J. Mater. Sci. Technol. - 2008. - Vol. 24, № 2. - P. 192 -196.
30. Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis / J. Rejman, V. Oberle, I. S. Zuhorn [et al.] // Biochem. J. - 2004. - Vol. 377. - P. 159 -169.
31. The fence and picket structure of the plasma membrane of live cells as revealed by single molecule techniques (Review) / K. Ritchie, R. Iino, T. Fujiwara [et al.] // Mol. Membr. Biol. - 2003. - Vol. 20, № 1. - P. 13 -18.
32. Interaction of nanoparticles with lipid membrane / Y. Roiter, M. Ornatska, A. R. Rammohan [et al.] // Nano Lett. - 2008. - Vol. 8, № 3. - P. 941 -944.
33. Interaction of lipid membrane with nanostructured surfaces / Y. Roiter, M. Ornatska, A. R. Rammohan [et al.] // Langmuir. - 2009. - Vol. 25, № 11. - P. 6287 -6299.
34. Strain specificity in antimicrobial activity of silver and copper nanoparticles / J. P. Ruparelia, A. K. Chatterjee, S. P. Duttagupta [et al.] // Acta Biomater. - 2008. - Vol. 4, № 3. - P. 707 -716.
35. Salaun C. Lipid rafts and the regulation of exocytosis / C. Salaun, D. J. James, L. H. Chamberlain // Traffic. - 2004. - Vol. 5, № 4. - P. 255 -264.
36. Si-supported mesoporous and microporous oxide interconnects as electrophoretic gates for application in microfluidic devices / R. Schmuhl, W. Nijdam, J. Sekulic [et al.] // Anal. Chem. - 2005. - Vol. 77, № 1. - P. 178-184.
37. Silvius J. R. Partitioning of membrane molecules between raft and non-raft domains: insights from model-membrane studies / J. R. Silvius // Biochim. Biophys. Acta. - 2005. - Vol. 1746, № 3. - P. 193-202.
38. Simons K. Model systems, lipid rafts, and cell membranes / K. Simons, W. L. Vaz // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. - 2004. - Vol. 33. - P. 269-295.
39. Simons K. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights / K. Simons, M. J. Gerl // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2010. - Vol. 11, № 10. - P. 688-699.
40. Singer S. J. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes / S. J. Singer, G. L. Nicolson // Science. - 1972. - Vol. 175, № 23. - P. 720-731.
41. Sondi I. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria / I. Sondi, B. Salopek-Sondi // J. Colloid Interface Sci. - 2004. - Vol. 275, № 1. - P. 177-182.
42. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents / P. K. Stoimenov, R. L. Klinger, G. L. Marchin [et al.] // Langmuir. - 2002. - Vol. 18, № 17. - P. 6679-6686.
43. Mechanisms of DNA separation in entropic trap arrays: a Brownian dynamics simulation / M. Streek, F. Schmid, T. T. Duong [et al.] // J. Biotechnol. - 2004. -Vol. 112, № 1-2. - P. 79-89.
44. Capillarity induced negative pressure of water plugs in nanochannels / N. R. Tas, P. Mela, T. Kramer [et al.] // Nano Letters. - 2003. - Vol. 3, № 11. -P. 1537-1540.
45. Cellular interaction of different forms of aluminum nanoparticles in rat alveolar macrophages / A. J. Wagner, C. A. Bleckmann, R. C. Murdock [et al.] // J. Phys. Chem. B. - 2007. - Vol. 111, № 25. - P. 7353-7359.
46. Nanoparticle-induced surface reconstruction of phospholipid membranes / B. Wang, L. Zhang, S. C. Bae [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2008. -Vol. 105, № 47. - P. 18171-18175.
47. Yeagle P. L. Cell Membrane Features / P. L. Yeagle // Encyclopedia of life sciences. - 2001. - P. 1-7.