Біоетичні аспекти нанотехнологій, наномедицини

За ініціативи президента НАН України академіка Б.Є. Патона та академіка НАН і НАМН України Ю.І. Кундієва більше 15 років тому розпочалася ґрунтов-на робота зі створення в Україні загальнодержавної служби з біоетики. Створено комітет з біоетики при НАН України. Комітети з біоетики створені при науково-дослідних інститутах, вищих навчальних медичних і фармацевтичних закладах. Світові положення з біоетики, зокрема прийнята ЮНЕСКО у жовтні 2005 року "Загальна декларація про біоетику та права людини", поставлені в Україні на законну основу. Завдання вчених України - обов’язкове впровадження положень біоетики при проведенні експериментальних та клінічних досліджень. Медико-біологічні дослідження з урахуванням біоетичних положень стосуються нових наукових напрямків, до яких належать нанотехнології та наномедицина.

Результати досліджень з нанонауки і нанотехнологій реально впроваджуються у практичну діяльність людини з 90-х років ХХ століття. Структури нанометрового масштабу починають відігравати все більше значення у фізиці твердого тіла, фізичній хімії, молекулярній біології, медицині, фармакології, фармації. Але нанотехнології - це в першу чергу промислова технологія. Тому природно виникає запитання, як будуть впливати різні продукти нанотехнологій на людину і довкілля [2, 7, 22].

Наноматеріали складаються із частинок розміром менше 100 нм, за розмірами займають проміжне положення між окремими атомами/молекулами та мікроорганізмами. Завдяки розміру, формі, хімічному складу, заряду, структурі та великій площі поверхні наночастинки мають унікальні властивості, що робить їх перспективними матеріалами для застосування у різноманітних галузях народного господарства [3, 8, 11, 12]. Це підтверджується високими темпами вивчення властивостей наноматеріалів, розробки нових нанотехнологій, швидким впровадженням їх у виробництво, а також обсягами фінансування. Так, у 2004 році у світі було виділено 8,6 мільярдів доларів США на розвиток нанотехнологій, а до 2012 року прогнозовані витрати на ці потреби склали 1 трильйон доларів США [23].

У медицині наночастинки мають перспективу застосування в ультрачутливому виявленні біомолекул, діагностичній візуалізації, фотодинамічній терапії, цільовій доставці лікарських речовин до органів-мішеней [15, 29, 30].

Швидке впровадження наноматеріалів у виробництво і все більш тісний кон­такт з ними живих організмів, у тому числі людини, супроводжується відсутністю ґрунтовних знань про їх можливий токсичний вплив.

Питання нанотоксичності неоднозначне і багатогранне, вимагає комплексного підходу. Однією з основних проблем у цій сфері є те, що нанотоксикологією на сучасному етапі переважно займаються не професійні токсикологи. Крім того, не розроблено стандартизованих методик проведення експериментів in vivo та in vitro, не встановлено чітких критеріїв безпечності наноматеріалів. Аналіз та інтерпретація результатів тих експериментів, що зараз проводяться, почасти утруднена через різницю у методичних підходах до постановки досліду, визначення параметрів токсичності, відсутність єдиних одиниць вимірювання кількості наночастинок (міліграм на мілілітр, молярність, міліграм на кілограм маси піддослідної тварини, кількість наночастинок на одну клітину), тощо. Це в значній мірі пояснює розбіжності в отриманих результатах.

Визначення залежності ступеня токсичності наночастинок від їх різновиду є одним із пріоритетних завдань нанотоксикології. Адже різноманітність наночастинок вражає. Це можуть бути ліпосоми, наноемульсії, нанополімери, керамічні наноструктури, золоті наноскорини, вуглецеві наноматеріали - фулерени та нанотрубки, останні в свою чергу можуть бути одно- або багатошаровими [24, 26]. І це ще далеко не повний перелік існуючих наночастинок. Кожен різновид наноматеріалу має, крім загальних, і свої особливі властивості, які слід вивчати у токсикологічному аспекті.

Одним з позачергових напрямків нанотоксикології має стати вивчення джерел отримання наночастинок та шляхів їх потрапляння в оточуюче середовище, накопичення, перерозподілу між його складовими (повітря, грунт, вода), стабільності, природи продуктів розпаду [23]. Відомо, що концентрація будь-якої речовини антропогенного походження в екосистемі прямо пропорційна використанню її у народному господарстві. Зважаючи на інтенсивність зростання темпів ужитку продуктів нанотехнологій, можна передбачити, що в найближчому майбутньому наночастинки посядуть одне з перших місць серед забруднювачів навколишнього середовища.

Окремими розділами нанотоксикології мають стати дослідження фармакокінетичних властивостей продуктів нанотехнології. Актуальним є вивчення шляхів потрапляння наночастинок у організм не лише людини, а й тварин і рослин, які вживаються у їжу. До цього ж розділу слід віднести виявлення особливостей абсорбції, розподілення, метаболізму та екскреції різних видів наночастинок.

Певні відомості з фармакокінетики наноматеріалів уже накопичено. На да­ний час найбільш розповсюдженим шляхом потрапляння наноречовин до організму є інгаляційний [18]. Це пов’язано з тим, що основна маса наночастинок, які потрапляють в організм людини - це продукти горіння на промислових об’єктах. Вважається, що, завдяки своїм малим розмірам, наночастинки можуть швидко долати біологічні бар’єри та розподілятися по організму. Nemmar A. Зі співавторами показали, що вже через одну хвилину після інгаляції вуглецеві наночастинки розміром близько 100 нм, мічені радіоактивним 99Tc, виявляються у крові [32].

До шлунково-кишкового тракту наночастинки можуть потрапити не лише напряму з їжею чи водою, а й разом зі слизом з дихальних шляхів. Jani P. зі співавторами повідомляють, що наночастинки, які потрапляють до кишечника, здатні проходити його слизову та розподілятися по організму гематогенним шляхом. Однак інша група вчених не виявила доказів того, що наночастинки, які потрапили per os, здатні всмоктуватися. Вони вважають, що наноматеріали виділяються з фекаліями, не потрапляючи до внутрішнього середовища. Дискусійним залишається питання можливості транскутанного шляху потрапляння наночастинок до організму хребетних, хоча є повідомлення про здатність квантових міток проникати у шкіру свиней. Причому проникливість залежить від розміру та хімічного складу зовнішньої оболонки мітки [20, 25, 27].

Нез’ясованими залишаються питання залежності фармакокінетики наноматеріалів від виду наночастинок, їх розмірів, форми. Абсорбція та розподіл по організму квантових міток залежить від форми, заряду, та хімічного складу зовнішньої оболонки, шляхів введення тощо. Подібні експерименти проводили із застосуванням багатошарових вуглецевих нанотрубок. Виявилося, що їхня властивість проникати через біобар’єри залежить від розміру та форми трубок [17]. Однак ця проблема в літературі не висвітлена в повній мірі.

Актуальним є вивчення механізмів розподілення наночастинок по організму та механізмів проникнення у клітину. Як для будь-якої речовини, для наночастинок основним механізмом "доставки" до органів є гематогенний шлях. Однак вже встановлено, що, принаймні, деякі наночастинки здатні переміщуватися аксональним транспортом та лімфатичними шляхами [30]. Так, у дослідах на щурах показано, що при інгаляції мічених мітками фулеренів [32] та карбонових наночастинок із середнім діаметром близько 35 нм [33], наноструктури накопичуються в нюховій цибулині мозку щурів, що вказує саме на нейрональний транспорт як шлях їх потрапляння у ЦНС. У цьому аспекті значну цікавість викликає властивість наночастинок зв’язуватися з білками під час перебування в організмі. B білках, на яких адсорбуються наночастинки, відбуваються конформаційні зміни [33]. Невідомо, як впливає на властивості наночастинок зв’язування з білками плазми крові. Чи мають наночастинки антигенні властивості, також до кінця не з’ясовано. Водночас, більш детальні відомості щодо фармакокінетичних власти-востей наночастинок знайти не вдалося. Вже з цих небагатьох даних видно визначальні особливості наноматеріалів, що вимагає їх поглибленого вивчення.

Особливої уваги у фармакокінетичних дослідженнях нанотоксичності має посісти метаболізм наночастинок у живому організмі. У літературі дані з перетворення наночастинок in vivo представлені набагато меншою кількістю робіт, ніж інші фармакокінетичні характеристики. Не відомо, наскільки безпечними чи навпаки небезпечними є для людини продукти їх біодеградації. У літературних джерелах є повідомлення про те, що полімерні наночастинки та суперпарамагнітні наноструктури оксиду заліза здатні розпадатися в організмі. Дослідження деяких авторів доводять, що ядра квантових міток з сульфідів кадмію та цинку залишаються інтактними протягом місяця в організмі лабораторних щурів [23].

Серед першочергових завдань токсикодинаміки наноматеріалів стоїть вивчення загальних закономірностей взаємодії наночастинок із живими організмами. Зовсім не дослідженими є типові патологічні процеси, що можуть викликатися наночастинками. Із сучасних джерел відомо, що одним із основних, якщо не головним, механізмів ушкодження наноструктурами є оксидативний стрес. Останній призводить до активації різних факторів транскрипції, які в свою чергу підвищують синтез прозапальних речовин [35]. Так, активація мітоген-активуючої протеїнкінази та ядерного фактора транскрипції наночастинками, які утворюються при згорянні, підвищує транскрипцію таких прозапальних речовин, як IL-8, IL-6 та фактора некрозу пухлина [34, 36]. У той же час, інші ав-тори наводять дані про активізацію процесів апоптозу при дії на клітини нирок in vitro одношарових вуглецевих нанотрубок [16].

Дискусійним залишається питання щодо прямої цитотоксичної дії наноматеріалів. У дослідженні Lovric et al. показано, що квантові мітки з CdTe ядром, вкриті меркаптопропіоновою кислотою, спричиняли прямий цитотоксичний ефект на клітини феохромоцитоми in vitro при концентрації 10 мг/мл. У той час як лише ядра цих же наночастинок були цитотоксичними вже в концентрації 1 мг/мл. Загиблі клітини мали всі ознаки апоптозу - конденсацію хроматину при інтактних мембранах. У дослідах цієї групи вчених вираженість цитолізу залежала від розміру, покриття, заряду квантових міток. Зменшення токсичності спостерігалося при додаванні до культури антидоту кадмію N-ацетилцистеїну. Застосування антиоксидантів (вітаміну Е) не впливало на цитотоксичність у цих експериментах [29]. Ці досліди вказують на те, що кадмійвмісні квантові мітки підлягають, принаймні частково, біодеградації, їхні токсичні ефекти можуть залежати і від хімічних сполук - продуктів їх розпаду. Водночас деякі дослідники не відмічали цитотоксичності наночастинок [14, 28].

У світовій літературі недостатньо висвітлено питання про фактори, що сприяють підвищенню токсичності наноматеріалів, або ж навпаки, її зменшують. Недослідженою також є взаємодія наноматеріалів та хворого організму, адже досліди проводили in vivo на здорових статевозрілих тваринах.

Важливим аспектом є залежність токсикодинаміки наночастинок від стадії індивідуального розвитку. Перш за все інтерес прикутий до дії наночастинок на ембріон та плід. Робіт з цього приводу знову ж таки обмаль. Хоча Dubertret зі співавторами, довели, що ін’єкція квантових міток з ядром із CdSe/ZnS та гідрофільною оболонкою у бластомери Xenopus викликала зміну фенотипу клітин у дозі 5х109 квантових міток на клітину. В дозі 2х109 квантових міток на клітину змін фенотипу не відмічалося [19]. Недоліком цього дослідження є те, що не вивчалися наслідки такого впливу наночастинок на фенотип новонародженої тварини та на хід постнатального розвитку. З огляду на особливості та вищу сприйнятливість дитячого та старечого організму, важливо дослідити взаємодію наноматеріалів саме за таких умов. Наявність патологічного процесу або стану вносить свої корективи в метаболізм взагалі та, скоріше за все, взаємодію з на­ночастинками, зокрема.

Переважна більшість робіт спрямована на вивчення гострої токсичності наночастинок, у той час як віддалені наслідки масивного надходження наноматеріалів до організму або ж хронічного їх потрапляння в організм протягом тривалого часу не вивчалися, хоча й викликають надзвичайну цікавість. Усі вище вказані аспекти нанотоксикології мають бути вивчені як in vitro, так і in vivo. Якщо експерименти на культурах клітин проводяться відносно інтенсивно, то дослідження на цілісних організмах - рідкість серед робіт з цієї сфери.

В Інституті медицини праці НАМН України (директор - академік Ю.І. Кундієв, пров. наук. співробітники - Т.К. Кучерук, В.А. Стежка) проведені дослі-дження з вивчення токсикологічних властивостей нанокремнезему при інгаляційному надходженні. Встановлено, що при інгаляції наночастинки кремнезему проявляють негативний вплив не тільки на легені, а й на інші органи (печінку, міокард, нирки). Токсикологічна активність залежить від розміру наночастинок. Частинки 6-7 нм зумовлюють більш виражені токсикологічні зміни, ніж наночастинки 54-55 нм. У цьому науковому закладі також проводяться дослідження (академік НАМН І.М. Трахтенберг) з вивчення впливу на організм важких металів, зокрема наносвинцю, та наукового обґрунтування засобів безпеки в умовах виробництва нанометалів, розробки лікарських засобів з метою профілактики можливих токсичних впливів таких наноматеріалів [4, 5, 10].

В Інституті гігієни та медичної екології імені О.М. Марзеєва НАМН України (директор - академік НАМН, проф. А.М. Сердюк) вперше створений відділ з вивчення безпеки нанотехнологій та наноматеріалів (зав. - проф. В.Ф. Бабій), у якому вивчаються протимікробні та токсикологічні властивості наносрібла та інших наночастинок [9].

На кафедрі гігієни праці та професійних захворювань Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (зав. кафедри - член-кор. НАМН Украї-ни, проф. О.П. Яворовський) проводяться дослідження з токсикології наносрібла при різних шляхах введення, а також вивчення умов праці при виробництві на­ночастинок [6].

Однак слід зазначити, що, не дивлячись на вивчення властивостей наноматеріалів, питанням безпеки їх застосування приділялося досить мало уваги. На думку спеціалістів з Королівського товариства та Королівської інженерної академії Великої Британії у 2004 році ця галузь помітно відставала від розвитку власне нанотехнологічної індустрії (Department for Environmental, food and rural affairs, 2007). На сьогодні дослідження негативного впливу наночастинок на живі організми та екологію активізувалося в усіх країнах світу [13, 21, 31].

Аналіз даних літератури показав, що наноматеріали володіють не тільки більш вираженою фармакологічною активністю, але в деяких випадках й більш вираженою токсичністю у порівнянні із звичайними мікрочастками, здатні проникати в незміненому вигляді через клітинні бар’єри, а також, через гематоенцефалічний бар’єр, в центральну нервову систему, циркулювати і накопичуватися в органах і тканинах, викликаючи більш виражені патоморфологічні зміни внутрішніх органів, можуть мати тривалий період напіввиведення. Токсичність наночастинок залежить від їх форми і розмірів. Так, дрібні частинки веретено-подібної форми викликають більш руйнівні ефекти в організмі, ніж подібні їм частки сферичної форми. Також при впливі на організм чітко простежується зв’язок "доза-ефект". За останні п’ять років кількість публікацій з нанотокси-кології стабільно збільшується, однак даних про негативну дію наночастинок на організми та екосистему в цілому недостатньо [1, 37].

Відомий український вчений-гігієніст, академік НАН і НАМН України Ю.І. Кундієв, характеризуючи біоетичні аспекти нанотехнологій й наноматері-алів, відмітив: "В той же час часто забувається про можливість непередбаченого впливу на людину й її геном, нехтується досить проста істина - у світі немає нічого ідеального. Тому потрібен ретельний аналіз не тільки науково-технічної, а й морально-етичної складової досягнень та подальшого розвитку нанотехнологій.

Розвиток таких напрямків як нанобезпека, нанотоксикологія не повинен бути другорядним. Саме біоетика повинна зламати існуючий стереотип, коли техно­логії, навіть найпривабливіші, широко впроваджуються без попереднього глибо-кого і всебічного вивчення" [4]. Вченим України доцільно враховувати та необхідно виконувати рекомендації Ю.І. Кундієва при проведенні наукових розробок з нанотехнологій, нанофармакології, нанотоксикології.

Російський фізіолог, лауреат Нобелівської премії І.П. Павлов (1840-1936) стверджував, що "Людина - найдосконаліший продукт земної природи. Та щоб насолоджуватися скарбами природи, людина має бути здорова, дужа й розумна". Допоможе цьому широке впровадження у наукові дослідження основних положень з біоетики, які викладені в декларації ЮНЕСКО.

Література

1. Глушкова А. В. Нанотехнологии и нанотоксикология - взгляд на проблему / А. В. Глушкова, А. С. Радилов, В. Р. Рембовский // Токсикологический вестник. - 2007. - № 6. - С. 4-8.
2. Гусев А. И. Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии / А. И. Гусев. -2-е изд испр. - М. : ФИЗМАТЛИТ, 2007. - 416 с.
3. Кобаяси Н. Введение в нанотехнологию / Н. Кобаяси ; [пер. с япон.]. - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний. 2007. - 134 с.
4. Кундієв Ю. І. Біоетика - шлях до більш майбутнього / Ю. І. Кундієв // Четвертий Національний конгрес з біоетики з міжнародною участю. - Київ, 2010. - С. 28-30.
5. Кучерук Т. К. Етичні питання при виробництві наноматеріалів та наночастинок / Т. К. Кучерук, Н. А. Сальникова, О. В. Демецька // Четвертий Національний конгрес з біоетики з міжнародною участю. - Київ, 2010. - С. 89-90.
6. Москаленко В. Ф. Екологічні і токсиколого-гігієнічні аспекти біологічної без-пеки нанотехнологій, наночастинок та наноматеріалів / В. Ф. Москаленко, О. П. Яворовський // Науковий вісник Національного медичного університету. - 2009. - № 3. - С. 25-35.
7. Нанонаука і нанотехнології: технічний, медичний та соціальний аспекти / Б. Патон, В. Москаленко, І. Чекман [та ін.] // Вісн. НАН України. - 2009. -№ 6. - С. 18-26.
8. Сергеев Г. Б. Нанохимия. - 2-е изд., испр. и доп / Г. Б. Сергеев. - М. : Изд-во МГУ, 2007. - 336 с.
9. Сердюк А. М. Біоетичні проблеми в сучасній гігієні та медичній екології / А. М. Сердюк // Четвертий Національний конгрес з біоетики з міжнародною участю. - Київ, 2010. - С. 37.
10. Трахтенберг І. М. Етичні аспекти впровадження наноматеріалів / І. М. Трахтенберг, О. Л. Апихтіна, Н. М. Дмитруха // Четвертий Національний конгрес з біоетики з міжнародною участю. - Київ, 2010. - С. 81-82.
11. Трефилов В. И. Фуллерены - основа материалов будущего / В. И. Трефилов. Киев : Изд-во АДЕФ - Украина, 2001. - 148 с.
12. Фостер Л. Нанотехнологии. Наука, инновации и возможности / Л. Фостер ; [пер. с анг.].- Москва : Техносфера, 2008. - 352 с.
13. Нанотоксикологія: напрямки досліджень (огляд) / І. С. Чекман, А. М. Сер дюк, Ю. І. Кундієв [та ін.] // Довкілля та здоров’я. - 2009. - Т. 1, № 48. - С. 3-7.
14. Noninvasive imaging of quantum dots in mice / B. Ballou, B. C. Lagerholm, L. A. Ernst [et al.] // Bioconjugates Chemistry. - 2004. Vol. 15, N.1. -P. 79-86.
15. Caruthers S. D. Nanotechnological applications in medicine / S. D. Caruthers, S. A. Wickline, G. M. Lanza // Current Opinion Biotechnology. - 2007. -Vol. 18. - P. 26-30.
16. Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells / D. Cui, F. Tian, C. S. Ozkan [et al.] // Toxicologycal Letters. - 2005. - Vol. 155. - P. 73-85.
17. De M. Biomimetic interaction of proteins with functionalized nanoparticales: a thermodynamic study / M. De, C. You, S. Srivastava // Journal of American Chemistry Society. - 2007. -Vol. 129. - P. 10747-10753.
18. Combustion-derived nanoparticles: a review of their toxicology following inhalation exposure / K. Donaldson, L. Tran, L. Jimenez [et al.] // Part Fipe Toxicol. - 2005. - Vol. 2. - P.10-14.
19. In vivo imaging of quantum dots encapsulated in phospholipid micelles / B. Dubertret, P. Skourides, D. J. Norris [et al.] // Science. - 2002. - Vol. 298, № 5599. - P. 1759-1762.
20. Pharmacokinetics of nanoscale quantum dots: in vivo distribution, sequestration, and clearance in rat / H. Fisher, L. Liu, K. Pang [et al.] // Adv Funct Mater. - 2006. - Vol. 16. - P. 1299-1305.
21. Hannah W. Nanotechnology, risk and the environment: a review / W. Hannah, P. B. Thompson // J. Environ. Monit. - 2008. - Vol. 10, №3. - P. 291-300.
22. Hans CF. Nanotoxicity: the growing need for in vivo study / C. F. Hans, C. W. War­ren // Current opinion in Biotechnology. - 2007. - Vol. 18. - P. 565-571.
23. Hardman R. A. Toxicologic Review of Quantum Dots: Toxicity Depends on Physicochemical and Environmental Factors / R. A. Hardman // Environmental Health Perspectives. - 2006. - Vol. 114. - № 2. - P. 165-172.
24. Metal nanoshells / L. R. Hirsch, A. M. Gobin, A. R. Lowery [et al.] // Annual Biomedicine. - 2006. - Vol. 34. - P. 15-22.
25. Hoet P. Nanoparticles - known and unknown health risks / P. Hoet, I. puske-Hohlfeld, O. Salata // Journal of Nanobiotechnology. - 2004. - Vol. 2. -P. 12-15.
26. Liposomal encapsulated anticancer drugs / R. D. Hofheinz, S. U. Gnad-Vogt, U. Beyer [et al.] // Anticancer Drugs. - 2005. - Vol. 16. - P.691-70.
27. Jani P. Nanoparticle uptake by the gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency / P. Jani, G. W. Halbert, J. Langridge // Journal of Pharmacology. - 1990. - Vol. 42. - P. 821-826.
28. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo / D. R. Larson, W. R. Zipfel, R. M. Williams [et al.] // Science. - 2003. - Vol. 300, № 5624. - P. 1434-1436.
29. Differences in subcellular distribution and toxicity of green and red emitting CdTe quantum dots / J. Lovric, H. S. Bazzi, Y. Cuie [et al.] // Journal of Molecular Medicine. - 2005. - Vol. 83, № 5. - P. 377-385.
30. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance / C. Medina, M. J. Santos-Martinez, A. Radomski [et al.] // pitish Journal of Pharmacology. - 2007. - Vol. 150. - P. 552-558.
31. Toxic potential of materials at the nanolevel / A. Nel, T. Xia, L. Madler [et al.] // Science. - 2006. - Vol. 311, № 5761. - P. 622-627.
32. Passage of inhaled particles into the blood circulation in humans / A. Nemmar, P. M. Hoet, B. Vanquickenborne [et al.] // Circulation. - 2002. - Vol. 105. -P. 411-414.
33. Oberdorster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C60) induce oxidative stress in the pain of juvenile largemouth bass / E. Oberdorster // Environmental and Health Perspectives. - 2004. - Vol. 112. - P. 1058-1062.
34. Acute exposure to diesel exhaust increases IL-8 and GRO-alpha production in healthy human airways / S. S. Salvi, C. Nordenhall, A. Blomberg [et al.] // American Journal of Respiratory Care Medicine. - 2000. - Vol. 161. -P. 550-557.
35. Persistent depletion of I kappa B alpha and interleukin-8 expression in human pulmonary epithelial cells exposed to quartz particles / R. F. Schins, A. McAlinden, W. MacNee [et al.] // Toxicological Application of Pharmacology. - 2000. -Vol. 167. - P. 107-117.
36. Diesel exhaust particles induced release of interleukin 6 and 8 by (primed) human ponchial epithelial cells (BEAS 2B) in vitro / P. A. Steerenberg, J. A. Zonnenberg, J. A. Dormans [et al.] // Lung Research. - 1998. - Vol. 24. - P. 85-100.
37. Subchronical inhalation toxity of silver nanoparticles / J. M. Sung, J. M. Ji, J. D. Park [et al.] // Toxicol Sci. - 2009. - Vol. 108, №2. - Р. 452-461.