Векторы в генотерапии рака: преимущество спор клостридий перед вирусами

Солидные (твердые) опухоли составляют почти 90% всех онкологических заболеваний. Одним из потенциально перспективных способов лечения таких опухолей является генотерапия. Наиболее эффективные методики генотерапии основаны на доставке в пораженные клетки больного терапевтических генов с помощью вирусов, называемых вирусными векторами. К сожалению, такой способ лечения раковых опухолей обладает несколькими серьезными недостатками. Во-первых, для достижения значимого эффекта необходимо вводить их непосредственно внутрь опухоли, что значительно ограничивает область их применения, поскольку многие новообразования формируются и образуют метастазы в органах, недоступных для инъекционного введения вирусов. Во-вторых, злокачественные опухоли содержат как раковые клетки, так и здоровые, т.е. они характеризуются гетерогенностью, препятствующей вирусному инфицированию всех раковых клеток опухоли. В-третьих, полноценному функционированию и воспроизводству вирусов в зараженных клетках препятствует гипоксия (недостаток кислорода), свойственная большинству солидных опухолей. Вследствие этого часть раковых клеток опухоли остается неинфицированной терапевтическими вирусами, что приводит к ее возрождению.

Ранее было показано, что анаэробные бактерии способны селективно колонизировать твердые опухоли при их систематической доставке в опухоль. К таким бактериям относятся спорообразующие клостридии. Споры клостридий можно использовать как удобную систему доставки генетического материала в пораженные клетки, поскольку их легко получать и хранить; они устойчивы к внешним воздействиям и обладают онколитическим действием (способностью разрушать опухоли). Исследования, проведенные на животных и человеке, показали, что деградация опухоли почти во всех случаях происходит только внутри самой опухоли, не затрагивая той ее части, которая находится на границе со здоровыми тканями, хорошо снабжаемых кровью и кислородом. Споры клостридий, содержащие собственные противоопухолевые белковые факторы, можно дополнительно трансфецировать онколитическими генами. На моделях солидных опухолей животных было продемонстрировано, что комбинация трансгенных спор клостридий с традиционной химио- или лучевой терапией значительно повышает эффективность лечения.

Споры клостридий обладают значительным преимуществом перед вирусными векторами в терапии солидных опухолей. Однако, перед тем как использовать споры клостридий в клинической практике, необходимо убедиться в том, что они воздействуют исключительно на злокачественные новообразования, не затрагивая здоровых тканей, и способны уничтожать как первичные опухоли, так и метастазы. Современные технологии позволяют удовлетворить этим требованиям.

Введение

Генотерапия - лечение заболеваний человека с помощью введения специальных терапевтических генетических конструкций в пораженные клетки организма, - развивается в последнее время в ускоренном темпе и может оказаться эффективным методом лечения онкологических заболеваний (1). К концу 2006 года число клинически протестированных протоколов для генотерапии различных видов рака достигло 854, что составило 66,6 % от общего количества клинических испытаний различных заболеваний с помощью генотерапии (2). Это отражает тот факт, что онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в странах Запада (3).

Эффективность генотерапии определяется, прежде всего, системой доставки терапевтического генетического материала – так называемой векторной системой. Известные векторные системы принято подразделять на вирусные и невирусные. К настоящему времени именно вирусные векторы, обладающие онколитическим действием и способные к самовоспроизведению (репликационно-компетентные), зарекомендовали себя как наиболее перспективные инструменты генотерапии рака (4,5). Однако такая методика лечения злокачественных новообразований имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью введения вирусов непосредственно внутрь опухоли, не всегда возможного из-за ее локализации или наличия метастазов. Большая часть известных вирусных векторов не обеспечивает инфицирования всех раковых клеток опухоли, что приводит к рецидивам (6). Несмотря на то, что многие вирусные векторы демонстрируют терапевтическое действие в тканях опухолей, изолированных у онкологических больных, пока не удалось получить достоверного подтверждения их клинической эффективности.

Солидные опухоли составляют 90% всех онкологических заболеваний. Все солидные опухоли объединяет общее свойство: по достижении ими 2 мм в диаметре, начинается ангиогенез – формирование новых кровеносных сосудов, питающих опухоль. Этот процесс индуцируется изменениями в микроокружении раковых клеток, такими как формирование неполноценных сосудов, появление участков гипоксии и возникновение гетерогенной популяции злокачественных клеток (7). Такое микроокружение благоприятно для роста анаэробных бактерий вида Clostridia. Клостридии - облигатные анаэробы, способные расти только при отсутствии кислорода в среде. Они обладают несколькими преимуществами перед другими бактериями, поскольку споры клостридий могут избирательно заселять участки твердых опухолей, подверженные гипоксии, прорастать в жизнеспособные клетки и размножаться, вызывая разрушение опухоли. Предварительные клинические испытания продемонстрировали безопасность для здоровья человека ряда непатогенных штаммов клостридий. Однако клостридии обладают одним недостатком в качестве способа лечения солидных опухолей. Как показали многочисленные эксперименты, практически во всех случаях онколизис прекращался на внешних границах опухолей, что объясняется неспособностью клостридий существовать в обогащенных кислородом участках опухолей, находящихся на границе со здоровыми тканями. По этой причине успешное лечение солидных опухолей с помощью клостридий возможно только в сочетании с другими методами, такими как химио- или радиочастотная терапия (8,9). Недавние эксперименты с непатогенными штаммами C. Novyi в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, включая винорельбин (vinorelbin) и доксетаксел (docetaxel), продемонстрировали высокую онколитическую активность. В настоящее время эта методика терапии проходит фазу I клинических испытаний (10).

Способность клостридий к селективной колонизации опухолей открывает широкие возможности для их использования в качестве векторов в генотерапии рака. Лечение солидных опухолей с помощью комбинации методов генотерапии спорами клостридий, несущих гены, которые кодируют белки с различным противораковым действием (11,12,13), и химио- или лучевой терапии дает лучшие результаты, чем терапия спорами клостридий без дополнительного генетического материала, вызывающего противораковый эффект (12).

Ниже представлен обзор известных вирусных систем, включающих вектора направленного действия, репликационно-дефектные (не способные к воспроизведению) вектора и репликационно-компетентные онколитические вирусы. Рассмотрены преимущества и недостатки их использования в генотерапии рака. Далее обсуждается разработка спор клостридий в качестве векторов для переноса терапевтического генетического материала, механизмы их действия, а также их преимущества и недостатки по сравнению с вирусными векторами.

Разработка и использование вирусных векторных систем для генотерапии рака

(А) Ретровирусные векторные системы

Одной из первых систем генотерапии стал ретровирусный вектор, сконструированный на основе вируса мышиного лейкоза Molonеy (MoMLV).

Ретровирусы – это РНК-содержащие вирусы, заражающие клетки путем слияния мембран вируса и клетки-мишени, с последующим образованием двунитевого ДНК-генома (провируса) по матрице вирусной РНК с помощью вирусного фермента - обратной транскриптазы. Формирование новых вирусных частиц происходит при усиленной наработке РНК-копий вирусного ДНК-генома в ядре клетки-хозяина и синтезе вирусных белков в цитоплазме клетки с последующим отпочковыванием готовых вирусных частиц, сопровождающимся гибелью клетки-хозяина.

Этот вектор обладает уникальной способностью инфицировать делящиеся клетки (14). ДНК-провирус MoMLV способен интегрироваться в геном делящихся клеток и передаваться по наследству вместе с клеточным геномом. Раковые клетки быстро растут и постоянно делятся, как, например, клетки глиомы - одной из наиболее распространенных опухолей мозга. Эксперименты по генотерапии модели глиомы на животных с помощью вектора на основе вируса MoMLV продемонстрировали низкую инфицируемость раковых клеток, что является распространенной проблемой в экспериментах in vivo. Вирусные векторы MoMLV оказались не способными охватывать весь объем опухоли (15). Для повышения эффективности этой вирусной системы разработали репликационно-компетентный вариант вирусного вектора MoMLV, способный к воспроизводству в инфицированных клетках (16). Однократное внутричерепное введение репликационно-компетентного варианта вирусного вектора MoMLV в ксенографты глиомы человека у мышей приводило к распространению этого вируса далеко за пределы места инъекции, затрагивая только раковые клетки: в здоровых тканях мышей вирусы не обнаружились (16).

В целом, клинические испытания с помощью векторных систем на основе вируса MoMLV составляют более 23% от клинических испытаний всех систем генотерапии различных заболеваний человека. Эксперименты на мышах не выявили значимого токсического эффекта, вызываемого этими вирусами. Несмотря на это, ретровирусные системы представляют потенциальную опасность для здоровья человека, поскольку способны активировать онкогены и блокировать опухолевые супрессорные гены в инфицированных клетках. К сожалению, онкогенный эффект ретровируса был подтвержден клинически: после инфицирования терапевтическим вектором MoMLV стволовых клеток костного мозга детей, страдающих тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (Severe Combine Immunodeficiency Disease - SCID) – тяжелым заболеванием, часто приводящим у гибели детей грудного и младшего возраста, у 4 из 11 детей развилась лейкемия (17). Для внедрения этих векторов в клиническую практику требуется провести дополнительные исследования, направленные на повышение их безопасности и на улучшение инфицирующей способности вирусов, необходимой для уничтожения максимального количества раковых клеток в солидных опухолях.