Многомерная биология XXI века и клиническая лабораторная диагностика

…время разбрасывать камни,
и время собирать камни...
Екклезиаст, 3:5

Одна из главных задач XXI века – остановить пандемическое распространение болезней цивилизации: сердечно-сосудистых, ишемической болезни сердца, диабета, метаболического синдрома, онкологических заболеваний. Что должна сделать лабораторная диагностика для решения этой задачи? Во-первых, уметь своевременно определять генетическую предрасположенность к возникновению наиболее серьезных патологий. Как становится все более очевидным, многие такие патологии могут вызваться мутациями. Во-вторых, с высокой достоверностью определять количественный показатель риска возникновения патологий, когда они еще находятся в клинически бессимптомном состоянии. Это позволит проводить мероприятия, предупреждающие развитие заболеваний. И, в-третьих, за счет динамического измерения новых биомаркеров проводить отслеживать реакции организма на терапию и на хирургическое вмешательство. Эти задачи уже успешно решаются. И происходит это благодаря революционным достижениям биологии XXI века – ее назвали многомерной биологией (high dimensional biology). В нее входят:

Геномика – идентификация всех генов человека и нарушений в них, приводящих либо к наследственным заболеваниям, либо к предрасположенности к ним.
Транскриптомика – идентификация всех матричных РНК, кодирующих белки, определение количества каждой индивидуальной мРНК, определение закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки.
РНомика – идентификация всех не кодирующих РНК, определение количества каждой индивидуальной нкРНК – определение закономерностей экспрессии всех нкРНК.
Метаболомика – идентификация и количественное определение всех метаболитов, синтезируемых (или находящихся) в данных клетках, тканях, органах и в биологических жидкостях.
Биоинформатика – использование вычислительной техники, математики и информационной теории для анализа и моделирования молекулярно-биологических систем, в особенности систем, состоящих из генов, РНК, белков и метаболитов и др. Создание баз данных.

Именно эти направления, для краткости называемые «-омиками» (omics – genomics, transcriptomics и т.д.), считаются основой медицины ХХI века.

Клиническая геномика и клиническая транскриптомика. Транскрипционные профили патологий

Реализация проекта «Геном человека» позволяет обнаруживать мутации в генах, приводящие к наследственным заболеваниям или к повышению вероятности возникновения многих патологий, таких, например, как онкологические, сердечно-сосудистые (атеросклероз), диабет, метаболический синдром, шизофрения и др. В практику лабораторной диагностики уже успешно внедрены методы идентификации мутаций, наиболее часто приводящих, например, к различным раковым заболеваниям. Эти методы основаны на применении ПЦР (полимеразной цепной реакции) и маркерных генов, содержащих нарушения, приводящие к конкретным патологиям. Развитие геномики патологий позволяет, однако, не только проводить их молекулярно-генетическую диагностику, но и, как следующий этап, определять интенсивность синтезов РНК и белков, имеющих отношение к возникновению и развитию заболеваний. Это делается с помощью определения транскрипционных профилей, характеризующих экспрессию всех генов, активных в данном образце.

Технологии, при этом применяемые, основаны на так называемых «ДНК-микрочипах» (DNA microarray). Такой генный чип – это твердая подложка, на которую в определенном порядке нанесены в виде точек индивидуальные гены (их ДНК). Чтобы определить, транскрибируется ли данный ген, на чип помещают (с определенными координатами) лишь его часть – олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид соответствует экспрессируемой части гена (экзону). Затем из образца (например, опухоль) выделяется вся (суммарная) РНК. На основе всех молекул РНК данного образца получают их ДНК-копии – кДНК (обратная транскрипция), которые флуоресцентно метят и потом проводят гибридизацию с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидами. Если в данных условиях какие-то точки с конкретными генами не гибридизуются, это значит, что данный ген не транскрибируется. Если же данная точка микрочипа «светится», значит олигонуклеотиды на этой площадке прогибридизовались с флуоресцентно меченой кДНК, ген транскрибируется.

Чтобы определить, является ли полученный результат ошибкой или нет, проводится сравнение двух объектов. Для этого берут образец А (патология), из него получают суммарную РНК и после обратной транскрипции всех ее молекул флуоресцентно метят (красным) все молекулы кДНК. То же проводят и с образцом В (норма), но метят молекулы кДНК другим цветом (зеленым). Затем проводят гибридизацию ДНК-микрочипа со смесью этих двух препаратов кДНК (конкурентная гибридизация – преимущественно образуют гибриды те молекулы, которых больше). Если сигнал в данной точке на чипе будет красным, значит в клетках А (патология) транскрипция данного гена сильней, чем в клетках В (норма) . Если сигнал зеленый, то транскрипция сильнее в клетках В (норма). Если красного и зеленого поровну, то получится желтый цвет. Таким образом, можно сравнивать уровень транскрипции данного гена в разных тканях и органах, в биологических жидкостях при норме и патологии, до терапии и в ее процессе, до хирургической операции и после.

Довольно часто термины «геномика», «транскриптомика» и «протеомика» употребляются в одном и том же значении – для обозначения анализа экспрессии всех генов данного образца – как на уровне синтеза мРНК, так и на уровне синтеза белков (1-3).

Транскриптом – набор всех РНК, находящихся в данном образце. Анализ транскриптома, определение качественного и количественного профиля всех синтезированных РНК, отражает синтез кодируемых ими белков, а так же синтез рибосомальных, транспортных и других РНК. Сравнение транскриптомов нормальных и патологических образцов позволяет идентифицировать новые маркеры, прослеживать изменение их уровней во времени, судить о динамике патологии, об эффективности проводимого лечения и прогнозировать его результат (4-6). Предполагается, что каждая болезнь, характеризуется своим, так сказать, «штрих-кодом» – уникальным паттерном уровней транскрипции набора генов, характерного именно для данной болезни. Разумеется, анализируют транскриптомы не методом «прищуренного глаза», а с помощью компьютерных методов распознавания образов.

Клиническая РНомика

Пожалуй, самой громкой сенсацией биологии конца ХХ стало открытие принципиально нового класса РНК. Практически во всех на этот счет исследованных эукариотных организмах неожиданно было обнаружено огромное количество различных РНК, которые не кодируют белков и не являются ни рибосомальными, ни транспортными. Играют они, в основном, регуляторную роль – влияют на экспрессию генов (чаще всего на уровне трансляции). Это так называемые микроРНК длиной 19-22 нуклеотида. К ним относятся и т.н. короткие интерферирующие РНК (si-RNA), которые выключают синтез определенных белков путем разрушения их мРНК. МикроРНК регулируют экспрессию генов после их транскрипции. Это может происходить за счет:

• репрессии трансляции мРНК,
• расщепления мРНК,
• ускорения распада мРНК.

В каждой микроРНК есть участок, комплементарный особому участку в той мРНК, которая при каких-то обстоятельствах подлежит инактивации. Таким образом, большинство мРНК имеют «черные метки», указывающие на возможность собственной деградации, а микроРНК, имеющие комплементарные участки, в нужный момент узнают «черные метки» и нацеливают на мРНК, приговоренные к ликвидации, предназначенные для этого ферменты и белки. С помощью РНомики содержащиеся в образцах микроРНК идентифицируются, определяется их концентрация. Как еще более неожиданно оказалось, изменения концентрации различных микроРНК свидетельствуют о большом числе различных патологий. И в клинической РНомике наступила «золотая лихорадка» по поиску «золотых» маркеров и предикторов (7-12).

Клиническая протеомика

Это идентификация и количественное определение всех индивидуальных белков, которые содержатся в образце (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, биопсия) и мониторинг изменения их концентраций. Протеом – совокупность всех белков, содержащихся в данном образце. Полный анализ протеома клеток, тканей, органов и биологических жидкостей проводится с помощью двумерного электрофореза с высоким разрешением и с последующей идентификацией индивидуальных белков за счет масс-спектрометрии. Это позволяет проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций.

Значительному прогрессу в области протеомики способствовали успехи масс-спектрометрического анализа пептидов. Масс-спектрометрия включает в себя четыре основных компонента. Во-первых, в ионном источнике масс-спектрометра из образца получают ионизированные пептиды или белки. Во-вторых, разделение ионов пептидов и белков происходит в анализаторе масс на основе их величины отношения массы к заряду (m/z). В-третьих, детектор ионов (времяпролетный масс-спектрометр) регистрирует отдельные ионы, с указанием значения m/z иона, количества ионов и времени пролета ионов от источника до детектора ионов.

Типичная последовательность операций при исследования в протеомике такова:

• отбор образца (клетки, ткань, биологическая жидкость),
• приготовление образца, лизис клеток, экстракция белков,
• изоэлектрофокусировка, электрофорез в 1-ом направлении,
• электрофорез в 2-ом направлении, полиакриламидный гель, додецилсульфат натрия,
• проявление белковых пятен на геле,
• анализ двумерной электрофореграммы (количество пятен, их расположение),
• выделение участков геля, содержащих индивидуальные белковые пятна,
• расщепление индивидуальных белков трипсином прямо в геле,
• масс-спектрометрический анализ:
  • масс-фингерпринтинг пептидов,
  • определение аминокислотных последовательностей фрагментов индивидуальных белков,