Данные молекулярно-цитогенетического исследования частоты нерасхождения хромосом (дисомии) в половых клетках пациентов с нарушением сперматогенеза при нормальном кариотипе и при нарушении хромосом (кариотип 46,ХУ,t (1;13); мозаицизм 47,ХХУ [6]/46,XY[94]; кариотип 47,XXY)

Ключевые слова:

нерасхождение хромосм, половые клетки, нарушение сперматогенеза, мужское бесплодие

Дисомия по половым хромосомам (гоносомам) является одной из распространенных форм хромосомопатии (синдром Клайнфельтера, поли Y и др.) у пациентов с мужским бесплодием [1-5]. Одной из причин развития таких заболеваний является внесение в зиготу мужской или женской половой клеткой лишней гоносомы при оплодотворении. Исследование хромосомного набора в самих половых клетках позволяет составить представление о частоте и причинах возникновения дисомии (нерасхождении) хромосом в гаметах. Это, в свою очередь, будет способствовать разработке профилактических мероприятий с целью снижения уровня хромосомопатий, передаваемых через половые клетки родителей.

Цитогенетическое исследование гамет человека ограничено трудностью получения материала. Практически доступны для анализа лишь мужские половые клетки и то при показаниях к проведению биопсии яичка. Кроме того, анализ хромосом на материале биопсии яичка был возможен лишь на тех стадиях сперматогенеза, на которых хромосомы конденсированы и визуализируются: в сперматоцитах в пахитене, диакинезе-метафазе I и в метафазе II. В зрелых мужских гаметах-сперматозоидах хроматин конденсирован и не пригоден для традиционного цитогенетического исследования. Лишь с конца 70-х годов был разработан метод гетерологичного оплодотворения ооцитов золотистого хомячка сперматозоидами человека, позволивший визуализировать хромосомы сперматозоидов и анализировать их [6, 7].

C развитием молекулярно-цитогенетических методов стало возможным с помощью хромосомоспецифичных ДНК-зондов проводить анализ хромосом не только в метафазных, но и интерфазных клетках, в том числе и в половых на разных стадиях их развития [8-13, 24].

Материалы и методы

Определяли частоту нерасхождения хромосом (гоносом и некоторых аутосом) у 17 пациентов с нарушением сперматогенеза при нормальном кариотипе (2-я группа) и у 7 пациентов при аномальном кариотипе (3-я группа). В качестве контрольной (1-й) группы обследовали 37 мужчин с нормальной спермограммой и нормальным кариотипом. Молекулярно-цитогенетический анализ гамет проведен у 3 пациентов из этой группы.

В схему клинико-генетического обследования [5] входило традиционное спермиологическое исследование эякулята [15], количественный кариологический анализ незрелых половых клеток (НПК) из эякулята, цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови, молекулярно-цитогенетическое исследование препаратов клеток эякулята [14].

Спермиологический анализ эякулята выполнялся дважды у большинства пациентов по методу, рекомендованному ВОЗ [15]. По результатам спермиологического анализа пациентов относили к одной из шести групп [15]. Суховоздушные препараты половых клеток из эякулята получали общепринятыми методами [16, 17] и окрашивали по методу Гимзы для проведения количественного анализа состава НПК по разработанному нами способу [18]. FISH-анализ на препаратах половых клеток из эякулята проводили по M.Guttenbach и соавт.[14].

В целях определения анеуплоидии в половых клетках как показателя нерасхождения хромосом в мейозе в 27 случаях были проведены молекулярно-цитогенетические исследования клеток эякулята. FISH проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для гоносом (Х и Y) и аутосом (хромосомы 1, 4, 10, 13+21, 18). В исследовании применяли хромосомоспецифичные ДНК-пробы из оригинальной библиотеки, предоставленные Ю.Б. Юровым [19, 20]. Аутосомные ДНК-пробы применяли для оценки нерасхождения соответствующих хромосом в мейозе.

Результаты и обсуждение

У 3 пациентов с нормальным кариотипом и нормоспермией (1-я группа) не выявлено дисомии хромосом X, Y, по данным молекулярно-цитогенетического исследования гамет.

У некоторых из обследованных нами 17 пациентов с нормальным кариотипом и нарушением сперматогенеза (2-я группа) выявлено увеличение числа дисомных гамет по сравнению с частотой дисомии в сперматозоидах у здоровых мужчин [10, 21]. Согласно данным [10, 21], уровень нерасхождения половых хромосом в сперматозоидах здоровых мужчин с нормальным кариотипом и спермограммой составляет 0,05-0,1%, а уровень нерасхождения аутосом - 0,04-0,4% (в зависимости от хромосомы) от общего числа подсчитанных клеток.

У одного из пациентов с астенозооспермией, у которого молекулярно-цитогенетический анализ сперматозоидов и сперматид проводили дважды, на двух образцах эякулята, полученных с интервалом в 7 мес, в 1-м образце выявлена дисомия по хромосоме 1 в 36% сперматозоидов, во 2-м - в 57% сперматозоидов.

У пациента с кариотипом 46,XY,t(1;13) и азооспермией на суховоздушных препаратах клеток эякулята выявлено лишь 10 сперматозоидов, в 3 из них определена дисомия хромосомы 1. Из 93 сперматид в 22 (около 24%) также определена дисомия хромосомы 1, в 1 сперматиде, а также в 1 из 148 проанализированных сперматоцитов выявлена трисомия по хромосоме 1. Возможно, что транслокация хромосом 13 и 1 у данного индивидуума является причиной нарушения расхождения хромосом в делениях созревания гамет и как следствие - дисомии по хромосоме 1 в сперматидах и сперматозоидах. Не исключено, что высока вероятность передачи лишней хромосомы при дисомии гамет потомству при использовании ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида). Поэтому в схеме клинического обследования следует проводить медико-генетическое консультирование пациента, молекулярно-цитогенетическое исследование гамет, преимплантационную и/или пренатальную диагностику плода на носительство хромосомной патологии [5].

Нами исследованы половые клетки 6 пациентов с синдромом Клайнфельтера (в одном случае - мозаичная форма). При молекулярно-цитогенетическом анализе частоты нерасхождения хромосомы Х в случае мозаицизма 47,XXY[94]/46,XY[6] дисомия выявлена в 43% сперматозоидов и сперматид, определены 3 гибридизационных сигнала и более в 22% клеток. У пациентов с кариотипом 47,XXY частота дисомии Х в сперматозоидах (если таковые выявлялись) и сперматидах колебалась от 6 до 40%. Столь высокую долю дисомии по хромосоме Х в гаметах пациентов с синдромом Клайнфельтера по сравнению с уровнем дисомии, в том числе по хромосоме Х, у мужчин с нормальным кариотипом и нормоспермией [10, 21] можно объяснить нарушением процесса конъюгации и затем - нерасхождения хромосом в мейозе у лиц с нарушением числа (как и у обследованных нами пациентов) или структуры хромосом в кариотипе. В принципе, и у индивидуумов с нормальным кариотипом в 20-25% сперматоцитов на стадии зиготены-пахитены происходит нарушение конъюгации хромосом, и такие клетки дегенерируют, что является физиологической селекцией на уровне гамет [22]. По-видимому, у пациентов с кариотипом 47,XXY высока частота нарушения мейоза на стадии зиготены-пахитены и лишь малая доля сперматоцитов завершает мейоз и переходит в сперматиды и сперматозоиды. Это подтверждается семиологическим исследованием состава НПК эякулята. Такая остановка процесса сперматогенеза приводит к интенсивной гибели половых клеток и может явиться причиной азоо- или олигозооспермии тяжелой степени. В литературе практически отсутствует информация относительно уровня хромосомных аномалий как в зрелых (сперматозоиды), так и в незрелых половых клетках (сперматоциты и сперматиды) у пациентов с полной формой синдрома Клайнфельтера [24].

При использовании гетерологичного оплодотворения ооцитов хомячка сперматозоидами пациента с кариотипом 47,XXY/46,XY (т.е. носителя мозаичного кариотипа) было выявлено увеличение частоты гипергаплоидии - 24,XY сперматозоидов до 0,9% [23]; данные о наличии 2% сперматозоидов с дисомией Х в эякуляте пациента с таким же мозаичным кариотипом были также получены ранее с помощью техники FISH [24]. Полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что у пациентов с кариотипом 47,XXY может, по-видимому, происходить предпочтительная конъюгация гомологичных гоносом (в этих случаях хромосомы ХХ) и некоторые из таких гамет способны проходить через мейоз, формируя сперматозоиды [10, 23]. Однако у таких пациентов и в сперматидах и в сперматозоидах высока доля клеток с нерасхождением хромосом, что необходимо учитывать при проведении ИКСИ.

Наши данные прежде всего подтверждают необходимость проведения медико-генетического консультирования, в том числе цитогенетического исследования по лимфоцитам периферической крови пациентов с бесплодием неясного генеза. Установление нормального кариотипа свидетельствует лишь о том, что отсутствуют нарушения числа и структуры хромосом, выявляемые традиционным цитогенетическим методом. Однако это не исключает вероятности наличия микроструктурных перестроек хромосом или генных мутаций, выявление которых требует использования иных, чем традиционные цитогенетические исследования, а именно: молекулярно-цитогенетических методов исследования. Кроме того, как свидетельствуют наши данные, при отсутствии генных и хромосомных нарушений вероятны аномалии развития самих гамет, происходящие и в результате нарушения в них хромосом (вследствие существования определенной автономии гаметогенеза в организме). Это говорит о необходимости проведения в ряде случаев бесплодия анализа поведения хромосом на разных стадиях гаметогенеза. Разработка и использование в последние годы в этих целях молекулярно-цитогенетических методов исследования значительно повысили разрешающую ценность диагностических подходов.