Определение качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов в составе биологически активных добавок с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Готтих М.Б., Ташлицкий В.Н.

Detection of qualitative and quantitative composition of anthocyanin pigments consisting of biologically active additions with high-performance liquid chromatography (HPLC)

Gottih M.B., Tashlitskii V.N.

NII of physicochemical biology named after Belozerskiyi A.N. MSU, Moscow

Purpose: Detection of qualitative and quantitative composition of bilberry anthocyanin pigments in 4 following drug spicemen: Focus (Akvion, Russia), Strix (Ferrosan, Denmark), Oculist (Diod, Russia), Chernika–Forte (Evalar, Russia).

Materials and methods: Total content of anthocyanin pigments in all spicemen was examined with HPLC.

Results and conclusion: All spicemen contain anthocyanin pigments but their concentration varies a lot.

Focus contains 18,6 mg of bilberry anthocyanin, Strix – 13,6 mg, Oculist – 2,3 mg and Chernika–Forte – 1,15 mg accordingly.

Введение

Черника (Vaccinium myrtillus) богата различными антоцианозидами, которые являются соединениями антоцианинов с гликозидами (углеводы) [1]. Гликозиды из состава антоцианозидов не проходят через клеточную мембрану, поэтому основу активности экстрактов состав­;ляют именно антоцианины. По структуре антоцианины очень схожи с флавоноидами [2].

Антоцианы помогают поддерживать целостность ка­пил­ляров и стабилизировать коллаген. Антоцианы также являются потенциальными антиоксидантами. Кли­ни­че­ские исследования показали, что черника эффективна при лечении болезней кровообращения, гипохромных анемиях, варикозном расширении вен и других венозных и артериальных заболеваниях. Антоцианы защищают вены и артерии, стабилизируя фосфолипиды эндотелиальных клеток и стимулируя синтез коллагена и мукополисахаридов, которые придают структурную целостность стенкам артерий. Антоцианы также предупреждают агрегацию и прилипание тромбоцитов к эндотелиальным поверхностям [3].

Антоцианы, извлекаемые из черники, способствуют синтезу светочувствительного пигмента сетчатки родоп­сина в фоторецепторах глаза, подавляют патологическую альдозо–редуктазную активность в тканях хрусталика и предупреждают развитие катаракты. Путем синтеза фосфолипидов клеточных мембран уменьшают хрупкость ка­пилляров, восстанавливают их проходимость при сосудистых расстройствах (тромбозах), что способствует улучшению трофики сетчатки глаза [1,3]. В связи с этим комплекс антоцианинов благотворно влияет на остроту зрения и способность видеть в сумерках (куриная или ночная слепота) [1,3]. Данный эффект объясняется ускорением регенерации родопсина и активацией ферментов сетчатки.

В настоящее время в России зарегистрированы не­сколько пищевых добавок офтальмологического профиля, содержащих экстракты черники. Это «Фокус», «Стрикс», «Черника–форте», «Окулист» и др.

Нами было проведено исследование по определению качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов в составе биологически активных добавок с помощью ВЭЖХ.

Цель исследования

Определение количественного и качественного содержания антоцианиновых пигментов черники в 4 образцах следующих препаратов: «Фокус» (производитель ЗАО АКВИОН, Россия), «Стрикс» (производитель Ferrosan, Да­ния), «Окулист» (производитель Диод, Россия), «Чер­ни­ка–фор­те» (производитель Эвалар, Россия).

Материалы и методы исследования

Для исследований в аптеках и аптечных пунктах были закуплены четыре образца биологически активных добавок для глаз, в состав которых входит черника: «Фокус», «Стрикс», «Окулист», «Черника–форте».

В работе данные образцы были зашифрованы следующим образом:

«Фокус» – № 1;

«Окулист» – № 2;

«Стрикс» – № 3;

«Черника–форте» – № 4.

Подготовка образцов для исследования

Образцы экстрагировали дистиллированной водой из расчета содержания антоцианинов 0,05–0,2 мг/мл [4]. Таблетка или содержимое капсулы тщательно измельчались в агатовой ступке. Для экстракции соответствующая навеска порошка каждого образца помещалась в пластиковую пробирку объемом 50 мл и добавлялся рассчитанный объем дистиллированной воды (от 10 до 50 мл в зависимости от навески и образца) для получения растворов с концентрацией 3,0; 8,0; 1,0 и 10,0 мг/мл для образцов 1–4 соответственно. Экстракция проводилась при непрерывном перемешивании на термошейкере C24KC Refrigerated incubator shaker Edison, NJ, USA при 160 об./мин, температуре 37°С в течение 30 мин. Из полученных растворов отбирались аликвоты объемом 1 мл, которые центрифугировали 10 мин при 14000 об./мин, фильтровали через Millex–GV13, 0,22 um, 13 mm Filter Unit, MILLIPORE и хранили при –10°С.

Для количественного определения суммарного содержания антоцианиновых пигментов методом рН–диффе­ренциальной спектрофотометрии образец № 4 был разбавлен дистиллированной водой в 10 раз соответственно.

Определение суммарного содержания антоцианиновых пигментов методом рН–дифференциальной спектрофотометрии.

Были использованы буферные растворы № 1 и № 2:

Раствор № 1: рН 1 – 0,405 мг КСl, 1,238 мл конц. НСl в 100 мл воды.

Раствор № 2: рН 4,5 – 1,64 г натрия ацетата в 100 мл воды и НСl до рН 4,5.

К 0,96 мл буферного раствора № 1 или № 2 добавляли 40 мкл экстракта, приготовленного как описано выше, и определяли оптическую плотность при 510 нм и 700 нм с соответствующим буфером в качестве раствора сравнения. Использовали УФ–спектрофотометр Cary 50bio производства Varian (США). Для каждого образца эксперимент проводили дважды.

Суммарное содержание антоцианиновых пигментов рассчитывали по формуле [4]:

С (?антоцианин, масс. %) = 100%?[(А510рН1– А700рН1) – (А510 рН4,5 – А700рН4,5)]?MW?F/(???l?C),

где

? и MW – коэффициенты молярного поглощения и молекулярная масса антоцианина, используемого в качестве стандарта (для цианидин–3–глюкозида 26900 и 449,2 соответственно);

F = 25 – коэффициент разведения;

l =1 – длина оптического пути кюветы, см;

C – концентрация приготовленного раствора образца, г/л.

Определение качественного состава антоцианиновых пигментов методом ВЭЖХ.

Качественный состав антоцианиновых пигментов определялся методом обращенно–фазной ВЭЖХ на колонке Luna C18(2) 4,6?150 mm (5um) производства Phenomenex (США). Используется градиентное элюирование с подвижной фазой А (0,151% раствор трифтор­уксусной кислоты в воде) и подвижной фазой В (0,151% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) по программе 5–40% В за 11 мин при скорости потока 1,5 мл/мин, температуре 25°С, с УФ–детекцией при 520 нм и УФ–спектральными данными от 230 до 800 нм. Был использован хроматограф Agilent1100, состоящий из четырехканального градиентного насоса с дегазатором, автосамплера, термостата и диод­но–мат­рич­ного детектора. Сбор и обработка хроматограмм осуществлялась с по­мощью программ «ChemStation B.01.03» и «ACD/SpecManager 10.05».

Для ВЭЖХ анализа образца № 1 с концентрацией 6 мг/мл использовалась аликвота 1 мкл, а для образцов № 2–4 с концентрацией 8, 10 и 10 мг/мл – аликвота 10 мкл. Анализ раствора каждого образца проводили дважды.

Результаты исследования и их обсуждение

С помощью УФ–спектрометрического анализа было исследовано суммарное содержание антоцианиновых пигментов во всех образцах. Полученные данные по двум независимым экспериментам приведены в таблице 1.

Как видно из полученных данных, все анализируемые образцы содержат антоцианиновые пигменты, однако их концентрация в разных образцах варьируется в широком диапазоне от 0,5 % (образец № 4) до 6,64 % (образец № 1), а содержание в одной таблетке или капсуле – от 1,1 мг до 18,35 мг.

Для определения качественного состава образцов

ис­поль­зовался метод обращенно–фазной ВЭЖХ (оф–ВЭЖХ). Полученные результаты приведены на ри­сун­ке 1. Отнесение пиков проводилось на основании времен удерживания и соотношения площадей. Времена удерживания и соответствующие площади пиков приведены в таблице 2. Как видно из хроматограмм и таблицы 2, качественный состав и соотношение компонентов всех исследованных образцов практически одинаковы (в пределах погрешности метода определения площади плохо разрешенных пиков) и соответствуют литературным данным для экстрактов черники [4].

Выводы

На основании полученных данных (качественный анализ методом оф–ВЭЖХ) можно утверждать, что все исследованные образцы препаратов действительно содержат антоцианиновые пигменты из экстрактов черники, а не из других природных источников. Однако количествен­;ное содержание этих соединений, определенное ме­то­дом рН–дифференциальной спектрофотометрии, варьи­рует в широком диапазоне и составляет для образцов:

№ 1 – 18,6±0,3 мг (6,6±0,1%);

№ 2 – 2,3±0,2 мг (1,01±0,09%);

№ 3 – 13,6±0,6 мг (2,9±0,1%);

№ 4 – 1,15±0,01 мг (0,48±0,01%).

Таким образом, в исследованных нами пищевых добавках офтальмологического профиля содержатся антоцианиновые пигменты из экстрактов черники в следующем количестве (препараты расположены в порядке убывания концентрации):

Фокус (ЗАО АКВИОН, Россия) – 18,6 мг;

Стрикс (Ferrosan, Дания) – 13,6 мг;

Окулист (Диод, Россия) – 2,3 мг;

Черника–форте (Эвалар, Россия) – 1,15 мг.

Статья принята в печать 20 июня 2007 г.

Литература

1. Nakaishi H., Matsumoto H., Tominaga S., Hirayama M. (2000) Altern Med Rev, 5 (6): 553–562.

2. Schmitt E., Stopper H. (2001) Nutrition and cancer, 41 (1–2): 145–149.

3. Head K.A. (2001) Altern Med Rev, 2:141–66.

4. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. МИНЗДРАВ РОССИИ. – Москва, 2004. – С. 106.