Длительная терапия ЦДФ-холином способствует функциональному восстановлению и увеличивает пластичность нейронов после инсульта

HURTADO O., CARDENAS A., PRADILLO J.M., MORALES J.R., ORTEGO F., SOBRINO T., CASTILLO J., MORO M.A., LIZASOAIN I., Departamento de Farmacologia, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, bServicio de Neurologia, Hospital Clinico Universitario, Santiago de Compostela, Spain

Резюме

Нарушение движений в верхних конечностях и мелкой моторики является наиболее частым последствием инсультов, резистентных к терапии. Несмотря на то что в последние годы проведен ряд исследований, направленных на повышение эффективности реабилитационных программ, фармакологические подходы в отношении вышеупомянутых последствий инсульта все еще остаются плохо разработанными. Мы решили выяснить влияние цитидиндифосфатхолина - безопасного и хорошо переносимого препарата с мембраностабилизирующими свойствами - на функциональные исходы и нейроморфологические изменения после инсульта. Степень функционального восстановления мы определяли с помощью лестничного теста ловкости и теста на отклонение приподнятого тела для оценки сенсомоторной интеграции и асимметричной моторной функции соответственно. Терапия ЦДФ-холином, начатая через 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) и продолжавшаяся в течение 28 дней, улучшала показатели функционального восстановления в лестничном тесте на ловкость (ОСМА + ЦДФ - 87,0 ± 6,6 % съеденных пищевых шариков по сравнению с ОСМА + физиологический раствор (ФР) - 40,0 ± 4,5 %; p < 0,05) и в тесте на отклонение приподнятого тела (ОСМА + ЦДФ - 70,0 ± 6,8 %, в группе ОСМА + ФР - 88,0 ± 5,4 %; контралатеральные отклонения, p < 0,05). С целью определения потенциальных нейрональных структур, ответственных за восстановление функций, мы исследовали морфологию дендритов пирамидальных клеток V слоя в неповрежденной моторной коре (окраска по Гольджи - Коксу). У животных, получавших ЦДФ-холин, было обнаружено улучшение структуры дендритов и увеличение плотности дендритных шипиков по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор. Полученные данные свидетельствуют о том, что длительная терапия ЦДФ-холином, инициированная через 24 ч после инсульта, способствует повышению пластичности нейронов в неповрежденных участках мозга (функционально связанных с поврежденными областями) и ускорению функционального восстановления.

Ключевые слова

ветвление дендритов, дендритные шипики, передние конечности, пластичность, сенсомоторный, инсульт

Введение

Инсульт является основной причиной смертности и длительной утраты трудоспособности, обусловливая тем самым высокую социоэкономическую нагрузку на общество. Среди тех, кто выжил к 30-му дню после первого инсульта, половина выживала и в течение последующих 5 лет, одна треть оставалась нетрудоспособной, один из семи больных нуждался в длительном стационарном лечении (Hankey и соавт., 2002). Принимая во внимание тот факт, что гемипарез - наиболее частая причина инвалидизации после инсульта (Duncan и соавт., 1992), разработка схемы лечения, направленного на эффективное восстановление двигательных функций у пациентов с данной патологией, является достаточно важной задачей. К сожалению, по состоянию на сегодняшний день в указанном направлении сделано очень мало. Большая часть рекомендаций сводится к реабилитации с помощью двигательных упражнений (Tarkka и соавт., 2005; Page и соавт., 2005) и назначению леводопы (Scheidtmann, 2004).

Точные механизмы восстановления моторных функций после инсульта не ясны. Однако известно, что самопроизвольное и постепенное восстановление некоторых двигательных навыков происходит в течение нескольких недель/месяцев после повреждения ткани мозга (Lashley, 1924; Travis и Woolsey, 1956) и это функциональное восстановление зависит от пластичности мозга в ипси- и контралатеральных гемисферах (см. обзоры Lee и van Donkelaar, 1995; Seil, 1997; Steinberg и Augustine, 1997; Johansson, 2000; Hallett, 2001; Nelles, 2004). Показано, в частности, что активация сенсомоторной коры на стороне, контралатеральной повреждению, наблюдается уже спустя 24 ч после развития инсульта и сохраняется в течение 3 дней (у животных - Abo и соавт., 2001; Dijkhuizen и соавт., 2001, 2003; у человека - Nelles и соавт., 1999; Cuadrado и соавт., 1999; Marshall и соавт., 2000). Более того, у крыс с фокальной ишемией наблюдали усиление ветвления дендритов пирамидальных клеток V слоя в пределах неповрежденной коры, с одновременным улучшением функции передних конечностей (Jones и Schallert, 1994; Biernaskie и Corbett, 2001; Biernaskie и соавт., 2004; Luke и соавт., 2004). Важно и то, что реорганизация аксонов в мозге крыс после инсульта сопровождалась восстановлением контроля коры над работой передних конечностей (Bury и Jones, 2002; Cheng и соавт., 2002; Wiessner и соавт., 2003; Dijkhuizen и соавт., 2003; Luke и соавт., 2004).

Цитидиндифосфатхолин (ЦДФ-холин) является промежуточным соединением в синтезе фосфолипидов клеточной мембраны. При введении извне данное вещество увеличивает содержание фосфатидилхолина и сфингомиелина в мембранах уже в первый день после инсульта (Adibhatla и соавт., 2001). В целом предполагают, что ЦДФ-холин может действовать как мембраностабилизатор. Однако работ, в которых бы изучалось влияние данного вещества на нейрональную пластичность после перенесенного инсульта, на сегодняшний день нет. Известно только, что ЦДФ-холин эффективен при алкогольной фетопатии (Patt и соавт., 1989).

В связи с вышеизложенным мы решили изучить, будет ли длительная терапия ЦДФ-холином, которая начата спустя 24 ч после развития ишемии, улучшать восстановление сенсомоторных функций с одновременным увеличением нейрональной пластичности в контралатеральной гемисфере. Фокальную ишемию моделировали у крыс с помощью окклюзии средней мозговой артерии.

Материалы и методы

• Животные

Исследование было выполнено на взрослых крысах-самцах линии Sprague-Dawley весом 260-270 г. Животных содержали при температуре 22 °С, световой/темновой периоды составляли 12 ч. Все поведенческие тесты проводили во время темновой фазы. Животных не ограничивали в потреблении пищи и воды, за исключением периодов поведенческого обучения и тестирования. Массу тела регистрировали ежедневно, между всеми экспериментальными группами не было достоверных различий по этому показателю. Все манипуляции выполняли в соответствии с рекомендациями, принятыми Комитетом по биоэтике Университета Комплутенсе (г. Мадрид), и правилами, действующими на территории Европейского Союза (DC 86/609/EU и 2003/65/EC).

• Манипуляции и экспериментальные группы

Животным выполняли наркоз изофлураном (3% - индукция наркоза, 1% - основной наркоз) в смеси с кислородом (30 %) и закисью азота (70 %). Длительную фокальную церебральную ишемию вызывали путем перевязывания левой общей сонной артерии (ОСА) и окклюзии ипсилатеральной средней мозговой артерии (ОСМА) в соответствии с ранее описанной методикой (Brint и соавт., 1988; Cardenas и соавт., 2002).

Животные были разделены на 4 экспериментальные группы (n = 22 в каждой экспериментальной группе): ложнооперированные крысы (ЛО), у которых осуществляли доступ к средней мозговой артерии, но окклюзию не вызывали; ОСМА - крысы с окклюзией средней мозговой артерии; ОСМА + ФР - крысы с окклюзией средней мозговой артерии, получавшие физиологический раствор; ОСМА + ЦДФ - крысы с окклюзией средней мозговой артерии, получавшие цитидиндифосфатхолин. ЦДФ-холин вводили ежедневно в дозе 1000 мг/кг/день интраперитонеально (Hurtado и соавт., 2005), начиная с 1-го дня после окклюзии средней мозговой артерии, в течение 28 дней. В каждой экспериментальной группе спустя 24 ч и 28 дней после воспроизведения модели 6 произвольно выбранных животных выводили из эксперимента для того, чтобы оценить объем инфаркта. У крыс забирали мозг и выполняли 7 фронтальных срезов толщиной 1 мм (Brain Matrix, WPI, Великобритания), окрашивали их в 1% 2,3,5-трифенилтетразола хлориде в 0,1 моль/л фосфатном буфере, после чего определяли объем инфаркта (мм3) в соответствии с ранее описанной методикой (Cardenas и соавт., 2002).

• Оценка функционального восстановления

Функциональное восстановление изучали путем определения сенсомоторной интеграции (использовали лестничный тест ловкости) и асимметричного моторного поведения (применяли тест на отклонение приподнятого тела). Все оценки были выполнены вслепую (исследователи не знали, какое лечение до этого получали животные).

Лестничный тест ловкости. За 1 неделю до моделирования повреждения мозга животных обучали брать съедобные шарики со специальной лестницы (Montoya и соавт., 1991; Biernaskie и соавт., 2004). Лестница (Campden Instruments, модель 80300 для крыс) состояла из центральной платформы, куда животным нужно было взобраться, чтобы достать до шариков, расположенных на 7 ступеньках. Животных лишали пищи не менее чем за 24 ч до обучения и тестирования, а также непосредственно во время выполнения этих процедур. Массу тела животных регистрировали ежедневно, в целом она не уменьшалась более чем на 80 % от первоначального уровня. Полный цикл тренировок включал 4 дня подряд, 2 раза в день (утром и после полудня) по 10 мин. Каждая лестница состояла из 7 ступенек, на каждой ступеньке располагалось по 3 шарика (шарики состояли исключительно из пищевых компонентов и имели одинаковый вес - 45 мг; Bio-Serv, Frenchtown, Нью-Джерси). По количеству съедаемых шариков оценивали степень активности передних конечностей. Следует отметить, что лестница для проведения данного теста сконструирована так, что оброненные шарики крыса достать уже не может. Поскольку животные с инсультом могут «жульничать», пытаясь достать языком до шариков, расположенных на двух верхних ступеньках лестницы, двигательную активность оценивали по пяти нижним ступенькам, с которых шарики можно было достать только с помощью передних конечностей. В первые 2 дня шарики располагали на ступеньках 1, 2 и 5, чтобы мотивировать животное к поиску пищи. На 3-й и 4-й день шарики располагали на 2-5-й ступеньках и подсчитывали общее количество шариков, съедаемых животными за эти дни. Если крыса не соответствовала критерию обучаемости (должно быть съедено минимум 12 шариков), ее исключали из наблюдения. После воспроизведения модели повреждения мозга у животных определяли двигательную активность передних конечностей описанным выше способом. Тест состоял из 10 подходов - 2 попытки в день в течение 5 дней. Три наилучших результата усредняли, что позволяло определить максимальный уровень выполнимости теста.

Тест на отклонение приподнятого тела. Во время проведения этого теста крысу удерживали за хвост руками и регистрировали направление отклонения головы от вертикальной оси (Borlongan и Sanberg, 1995). Сперва животное помещали в плексигласовую камеру (40 х 40 х 35,5 см) и давали ему возможность адаптироваться в течение 2 мин и занять нейтральную позицию, зависящую от взаимного расположения всех четырех лап. Затем животное поднимали на 2 см над уровнем пола и регистрировали отклонение головы от вертикальной оси вправо или влево (угол отклонения должен превышать 10°). Перед оценкой следующего отклонения головы крыса должна была занять исходное вертикальное положение. В ряде случаев, когда животное отказывалось занимать вертикальное положение или когда крыса хватала себя за хвост, ее опускали на пол. После того как крыса занимала нейтральную позицию, тест повторяли вновь. В общей сложности у одного животного регистрировали 30 отклонений головы.

• Нейрональная пластичность

После выполнения всех запланированных поведенческих тестов животным вводили большую дозу пентобарбитала натрия и осуществляли транскардиальную перфузию физиологическим раствором. Мозг аккуратно извлекали для последующего изучения нейрональной пластичности.

Нейрональную пластичность исследовали путем изучения морфологии дендритов (оценка порядка ветвления и анализ Шолла) и плотности дендритных шипиков в пирамидных клетках V слоя неповрежденной моторной коры. С этой целью весь извлеченный мозг погружали на 14 дней в модифицированный раствор Гольджи - Кокса (Glaser и Van der Loos, 1981), а затем на 2 дня помещали в 30% раствор сахарозы. После этого делали срезы мозга толщиной 200 мкм. В анализ включали произвольно выбранный (но для всех животных одинаковый) набор срезов мозга между +3,7 мм кпереди и -5,8 мм кзади от брегмы (Paxinos и Watson, 1997). Срезы помещали на предметные стекла, покрытые 2% желатином, и окрашивали в соответствии с ранее описанной методикой (Gibb и Kolb, 1998). Перед началом изучения стекол их кодировали, чтобы исследователю не были известны условия ранее проведенного эксперимента.

Реконструкцию нейронов выполняли в соответствии с описанной ранее методикой (Biernaskie и Corbett, 2001; Biernaskie и соавт., 2004) с использованием системы Neurolucida (Microbrightfield, Colchester, Вермонт). И апикальные, и базальные дендриты V слоя пирамидных клеток неповрежденной гемисферы, расположенные в пределах моторной коры, связанной с передними конечностями (Neafsey и соавт., 1986), были видны при увеличении в 250 раз. От каждого животного хорошо визуализировались 6-10 клеток, и отходящие от их основания ветви были исследованы с помощью анализа Шолла, определения центробежного порядка ветвления (Coleman и Riesen, 1968) и плотности шипиков. В анализ включали клеточные тела только тех пирамидных нейронов, которые были расположены внутри моторной коры, связанной с передними конечностями (исследовали наиболее каудальные отделы данной области; приблизительно это соответствует расстоянию от брегмы кпереди на +2 мм). Кроме того, чтобы тело нейрона было включено в анализ, оно должно было быть полностью импрегнированным, видным непосредственно в месте среза и не должно быть закрыто другими дендритами, глиальными клетками и кровеносными сосудами. Репрезентативная фотография клетки, импрегнированной по методу Гольджи - Кокса.

При выполнении анализа Шолла ряд концентрических сфер центрируют на теле нейрона. Сферы вложены друг в друга таким образом, что каждая последующая больше предыдущей на фиксированный прирост радиуса. В ходе анализа подсчитывали количество пересечений, которое образуют дендриты со сферой заданного радиуса.

При определении порядка ветвления поступали следующим образом: дендриты, отходящие непосредственно от тела клетки, считали ветвями первого порядка. Ветви, следующие за первой бифуркацией, считали ветвями второго порядка и т.д.

Плотность шипиков исследовали с дистального конца каждой реконструированной пирамидальной клетки V слоя. В каждой из таких клеток были видны сегменты одной дистальной базальной (третий порядок или выше) и одной дистальной апикальной ветви из нижней половины апикального дерева. Дендрит рассматривали при увеличении в 1000 раз, что позволяло рассчитывать точную длину сегмента дендрита. Плотность шипиков рассчитывали на сегменте длиной 50 мкм и выражали как число шипиков/10 мкм. Мы не предпринимали попыток подсчитать те шипики, которые были скрыты под или над сегментом дендрита. Поэтому полученные значения плотности шипиков, по всей видимости, несколько меньше реальных значений.

• Химический и статистический анализ

ЦДФ-холин был произведен фирмой Ferrer Internacional (Барселона, Испания). Все результаты выражены в виде средних значений (М) и их стандартных отклонений (m). Данные всех поведенческих тестов анализировали с помощью ANOVA (дисперсионный анализ). Ветвление дендритов и плотность шипиков, рассчитанные для разных клеток одного и того же животного, усредняли. Значения, вычисленные подобным способом для всех животных, использовали в дисперсионном анализе для выявления межгрупповых различий с помощью апостериорного критерия PLSD Фишера. Достоверность различий между данными, касающимися объема инфаркта, оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверность различий между поведенческими и анатомическими данными оценивали с помощью апостериорного критерия Ньюмана - Кейлса. Уровень значимости (p) во всех случаях был < 0,05.

Результаты

• Объем инфаркта

Чтобы убедиться в том, что неодинаковое выполнение поведенческих тестов не было связано с различиями в объеме инфарктов, в каждой группе животных оценили объем ткани, пораженной инфарктом, до (спустя 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии) и после лечения (спустя 28 дней после окклюзии средней мозговой артерии). На рис. 2А показано топографическое расположение ишемического инфаркта, затрагивавшего, как правило, латеральные области коры и подлежащий стриатум. Результаты свидетельствуют о том, что между экспериментальными группами не было достоверных различий по объему инфаркта ни спустя 24 ч (ОСМА - 335 ± 17 мм3; ОСМА + ФР - 340 ± 15 мм3; ОСМА + ЦДФ - 93 ± 9 мм3; n = 6), ни спустя 28 дней после лечения (ОСМА - 87 ± 7 мм3; ОСМА + ФР - 90 ± 8 мм3; ОСМА + ЦДФ - 338 ± 20 мм3; n = 6). Полученные значения были сходны с теми, которые были опубликованы нами ранее (Cardenas и соавт., 2002).

• Влияние длительной терапии ЦДФ-холином на восстановление двигательных функций

Лестничный тест ловкости. На рис. 3А отражена двигательная активность контралатеральной передней конечности. Процент съеденных шариков был получен как соотношение шариков, съедаемых во время эксперимента, к количеству шариков, которые животные съедали во время обучения. У крыс группы ЛО не было обнаружено какого-либо поведенческого дефицита. Между группами ОСМА и ОСМА + ФР не было обнаружено достоверных различий (эти данные на рисунке не представлены). Значительное влияние ЦДФ-холина на поведенческую активность впервые было зарегистрировано на 14-й день после моделирования повреждения (ОСМА + ЦДФ - 87,0 ± 6,6 % съеденных шариков по сравнению с ОСМА + ФР - 40,0 ± 4,5 %; n = 16, p < 0,05).

Тест на отклонение приподнятого тела. У ЛО крыс не было зафиксировано преобладания наклонов головы в ту или другую сторону - в течение эксперимента вправо и влево было выполнено примерно по 50 % наклонов. Между группами ОСМА и ОСМА + ФР не было обнаружено достоверных различий (эти данные на рисунке не представлены). В группе, получавшей ЦДФ-холин, существенный эффект впервые был обнаружен на 21-й день после моделирования повреждения (рис. 3Б; ОСМА + ЦДФ - 70,0 ± 6,8 %, в группе ОСМА + ФР - 88,0 ± 5,4 %; контралатеральные наклоны, n = 16, p < 0,05).

• Влияние длительной терапии ЦДФ-холином на нейрональную пластичность

Сложность ветвления дендритов. Сложность ветвления дендритов представлена в виде результатов оценки порядка ветвления и анализа Шолла. Об увеличении сложности базального ветвления в группе, получавшей ЦДФ-холин, свидетельствует тот факт, что количество ветвей, приходящихся на конкретный порядок ветвления, стало больше и что количество пересечений между дендритами и сферами при увеличении расстояния от тела нейрона также возросло (рис. 4Б). Терапия ЦДФ-холином оказывала значительное влияние на ветви третьего (ОСМА + ЦДФ - 9,33 ± 0,4 и ОСМА + ФР - 7,9 ± 0,6; n = 10, p < 0,05), четвертого (6,6 ± 0,3 и 4,9 ± 0,4; n = 10, p < 0,05) и пятого (4,6 ± 0,4 и 3,7 ± 0,2; n = 10, p < 0,05) порядков. Кроме того, в группе, получавшей ЦДФ-холин, было обнаружено значительное количество пересечений на расстоянии 40-180 мкм от тел нейронов в сравнении с группой, получавшей физиологический раствор (n = 10, p < 0,05).

Плотность шипиков. Статистический анализ выявил значительное отличие в плотности шипиков на дистальном конце базальных ветвей в группе, получавшей ЦДФ-холин (ОСМА + ЦДФ - 7,5 ± 0,1 и ОСМА + ФР - 5,5 ± 0,1; n = 10, p < 0,05).

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют о том, что длительная терапия ЦДФ-холином, начатая спустя 24 ч после развития инсульта, повышает нейрональную пластичность и вносит вклад в восстановление сенсомоторной функции. В последние несколько лет в ряде работ также исследовали вклад пластичности дендритов в восстановление сенсомоторной функции после инсультов (Adkins и соавт., 2004; Biernaskie и Corbett, 2001; Biernaskie и соавт., 2004, 2005). В связи с этим важно отметить, что лишь небольшое количество веществ способно стимулировать пластичность нейронов: ряд факторов роста (фактор роста нервов, нейротрофический фактор мозга) и антитела к ингибитору роста аксонов типа А (Mervis и соавт., 1991; Kolb и соавт., 1996; Tolwani и соавт., 2002; Papadopoulos и соавт., 2006). Небольшое количество препаратов (D-амфетамин, флуоксетин, остеогенный протеин типа 1) способно облегчать восстановление сенсомоторных функций (Kawamata и соавт., 1998; Stroemer и соавт., 1998; Adkins и Jones, 2005; Zhao и соавт., 2005). Использование всех перечисленных средств ограничено из-за недостаточной биодоступности и наличия побочных эффектов. Насколько нам известно, настоящая работа является первым сообщением, в котором показано, что длительная терапия ЦДФ-холином - препаратом, безопасным и хорошо переносимым при терапии инсульта, усиливает нейрональную пластичность и, как следствие, способствует восстановлению сенсомоторных функций.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что длительная терапия ЦДФ-холином способствует улучшению сенсомоторной функции. Для оценки степени восстановления сенсомоторной функции мы выбрали лестничный тест ловкости - благодаря простоте и надежности его широко используют для исследования моторного дефицита после развития инсульта (Biernaskie и Corbett, 2001; Wiessner и соавт., 2003; Biernaskie и соавт., 2004). Кроме того, данный тест предоставляет дополнительную информацию о состоянии сенсомоторной интеграции (Montoya и соавт., 1991; Baird и соавт., 2001). Наши результаты с использованием лестничного теста показывают, что длительная терапия ЦДФ-холином улучшает сенсомоторную функцию после инсульта, что характеризуется большим выдвижением «поврежденной» лапы и усилением ее способностей к схватыванию предметов. Кроме того, терапия ЦДФ-холином повышает первичную моторную функцию, о чем свидетельствует улучшение выполнение теста на отклонение приподнятого тела. Последний также используют для оценки асимметричного двигательного поведения у крыс после инсульта (Borlongan и Sanberg, 1995; Ishibashi и соавт., 2003; Vendrame и соавт., 2004). Полученные данные согласуются с нейроанатомическими результатами, поскольку среди изученных нейронов имеются те, которые дают проекции к области стриатума, связанной с передними конечностями: среди пирамидальных нейронов V слоя более 40 % клеток дают проекции к дорсовентральному стриатуму (Gerfen, 1989; Gabbott и соавт., 2005), и те, которые дают проекции в спинной мозг крыс (Coleman и Riesen, 1968). Следовательно, весьма вероятно, что ЦДФ-холин улучшает двигательную активность передних конечностей, воздействуя на различные компоненты данного акта. Восстановление сенсомоторной функции, вызванное ЦДФ-холином, не может быть объяснено разницей в функциональных исходах вследствие неодинакового повреждения ткани, поскольку какой-либо разницы в объеме инфаркта среди животных экспериментальных групп обнаружено не было.

Что касается кортикальной пластичности, мы обнаружили увеличение и сложности дендритов, и плотности шипиков пирамидальных нейронов V слоя сенсомоторной коры, контралатеральной инсульту, в группе животных, получавших ЦДФ-холин. Эти данные могут быть причиной наблюдаемого функционального улучшения после инсульта, поскольку предполагается, что изменение сложности дендритов связано с восстановлением сенсомоторных функций после приема препаратов (Kolb и соавт., 1996, 1997; Adkins и соавт., 2004) или реабилитационных нагрузок (Jones и соавт., 1999; Biernaskie и Corbett, 2001; Biernaskie и соавт., 2004, 2005). Мы уже упоминали, что активация сенсомоторной коры, контралатеральной повреждению, наблюдается уже спустя 24 ч после инсульта и сохраняется в течение 3 дней у животных (Abo и соавт., 2001; Dijkhuizen и соавт., 2001, 2003) и людей (Nelles и соавт., 1999; Cuadrado и соавт., 1999; Marshall и соавт., 2000). Наши результаты согласуются с ранее полученными данными о том, что у животных с крупными инфарктами, затрагивающими многие мозговые структуры, такими, например, которые развиваются в результате окклюзии средней мозговой артерии, включается реорганизация в отдаленных областях (неповрежденной гемисфере) (Jones и соавт., 1999; Biernaskie и соавт., 2004, 2005). У людей повреждение первичной моторной коры также вызывает компенсаторное вовлечение неповрежденной гемисферы (Feydy и соавт., 2002).

Хотя наше исследование было ограничено изучением только двигательной коры, контралатеральной инфаркту, большое количество экспериментальных и клинических данных свидетельствует о том, что интенсивное нейрональное и синаптическое ремоделирование кортикальных областей происходит и вокруг очага повреждения (см. обзоры Hallett, 2001; Nelles, 2004). В нашем исследовании мы не изучали этот вопрос, но не исключаем возможность вовлечения ипсилатеральной гемисферы в наблюдаемое улучшение сенсомоторной функции. Следовательно, необходимо провести дополнительные исследования по оценке влияния ЦДФ-холина на процессы, происходящие в ипсилатеральной гемисфере.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что длительная терапия ЦДФ-холином увеличивает нейрональную пластичность и вносит вклад в восстановление сенсомоторной функции. В ранее выполненных исследованиях сообщалось о восстановлении сенсомоторной функции после инсульта при длительном лечении ЦДФ-холином, однако пластические изменения в мозге зафиксированы не были (Aronowski и соавт., 1996; Rejdak и соавт., 2001). Немного известно о тех механизмах, которые лежат в основе обнаруженных нами пластических изменений. Описано, что низкие уровни глутатиона и активация перекисного окисления липидов могут снижать синаптическую пластичность (Mattson, 1998; Almaguer-Melian и соавт., 2000). В то же время нейротрофические факторы роста, такие как фактор роста нервов, нейротрофический фактор мозга и основной фактор роста фибробластов (Kolb и соавт., 1996; Tolwani и соавт., 2002), могут усиливать пластичность мозга в областях, ипси- и контралатеральных повреждению. ЦДФ-холин является посредником в биосинтезе фосфатидилхолина, который состоит из двух основных молекул - цитидина и холина (см. обзор Adibhatla и соавт., 2001). ЦДФ-холин может увеличивать пластичность нейронов несколькими путями. Во-первых, было показано, что ЦДФ-холин стимулирует синтез глутатиона и снижает перекисное окисление липидов (Adibhatla и соавт., 2001), вследствие чего может повышать синаптическую пластичность. Во-вторых, введение ЦДФ-холина после развития ишемического инсульта уменьшает высвобождение глутамата (Hurtado и соавт., 2005), большие концентрации которого могут снижать синаптическую пластичность путем активации NMDA-рецепторов (Mattson, 1998). Наконец, хорошо известно, что фосфолипиды мембран, подобные фосфатидилхолину, необходимы для роста и восстановления клеток и особенно для выполнения ими синаптической функции. В связи с этим следует отметить, что введение ЦДФ-холина крысам увеличивает содержание в мозге фосфатидилхолина и цитидина, причем последний активно превращается в уридин (Trovarelly и соавт., 1982; Richardson и соавт., 2003). Интересно, что уридин способен усиливать рост дендритов, вызванный фактором роста нервов (Wang и соавт., 2005). Пероральный прием ЦДФ-холина увеличивает содержание уридина у людей (см. обзор Adibhatla и соавт., 2001). Несмотря на все то, о чем было сказано выше, необходимо проводить дальнейшие исследования, чтобы точно выяснить механизмы, с помощью которых ЦДФ-холин повышает нейрональную пластичность.

Подводя итоги, следует отметить, что длительная терапия ЦДФ-холином, начатая спустя 24 ч после развития инсульта, увеличивает пластичность нейронов в пределах неповрежденной коры и вносит вклад в восстановление сенсомоторной функции. С учетом того факта, что интенсивные исследования цитиколина на волонтерах и пациентах подтвердили хорошую переносимость и безопасность этого препарата (Davalos и соавт., 2002), результаты нашего исследования подтверждают целесообразность включения данного средства в терапию больных с инсультами для ускорения процесса их реабилитации.

Литература
1. Abo M., Chen Z., Lai L.J., Reese T., Bjelke B. Functional recovery after brain lesion-contralateral neuromodulation: an fMRI study // NeuroReport 2001; 12, 1543-1547.
2. Adibhatla R.M., Hatcher J.F., Dempsey R.J. Effect of citicoline on phospholipids and glutathione levels in transient cerebral ischemia // Stroke 2001; 32, 2376-2381.
3. Adkins D.L., Jones A.T. D-Amphetamine enhances skilled reaching after ischemic cortical lesions in rats // Neurosci. Lett. 2005; 380, 214-218.
4. Adkins D.L., Voorhies A.C., Jones A.T. Behavioral and neuroplastic effects of focal endothelin-1 induced sensorimotor cortex lesions // Neuroscience 2004; 128, 473-486.
5. Almaguer-Melian W., Cruz-Aguado R., Bergado J.A. Synaptic plasticity is impaired in rats with a low glutathione content // Synapse 2000; 38, 369-374.
6. Aronowski J., Strong R., Grotta J.C. Citicoline for treatment of experimental focal ischemia: histological and behavioral outcome // Neurol. Res. 1996; 18, 570-574.
7. Baird A.L., Meldrum A., Dunnet S.B. The staircase of skilled reaching in mice // Brain Res. Bull. 2001; 54, 243-250.
8. Biernaskie J., Corbett D. Enriched rehabilitative training promotes forelimb motor function and enhanced dendritic growth after focal ischemic injury // J. Neurosci. 2001; 21, 5272-5280.
9. Biernaskie J., Chernenko G., Corbett D. Efficacy of rehabilitative experience declines with time after focal ischemic brain injury // J. Neurosci. 2004; 24, 1245-1254.
10. Biernaskie J., Szymanska A., Windle V., Corbett D. Bi-hemispheric contribution to functional motor recovery of the affected forelimb following focal ischemic brain injury in rats // Eur. J. Neurosci. 2005; 21, 989-999.
11. Borlongan C.V., Sanberg P.R. Elevated body swing test: a new behavioral parameter from rats with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism // J. Neurosci. 1995; 15, 5372-5378.
12. Brint S., Jacewicz M., Kiessling M., Tanabe J., Pulsinelli W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1988; 8, 474-485.
13. Bury S.D., Jones T.A. Unilateral sensorimotor cortex lesions in adult rats facilitate motor skill learning with the «unaffected» forelimb and training-induced dendritic structural plasticity in the motor cortex // J. Neurosci. 2002; 22, 8597-8606.
14. Cardenas A., Moro M.A., Leza J.C., OrShea E., Davalos A., Castillo J., Lorenzo P., Lizasoain I. Up-regulation of TACE/ADAM17 after ischemic preconditioning is involved in brain tolerance // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002; 22, 1297-1302.
15. Cheng P., Goldberg D.E., Kolb B., Lanser M., Benowitz L.I. Inosine induces axonal rewiring and improves behavioral outcome after stroke // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 13, 9031-9036.
16. Coleman P.D., Riesen A.H. Environmental effects on cortical dendritic fields I. Rearing in the dark // J. Anat. 1968; 102, 363-374.
17. Cuadrado M.L., Egido J.A., Gonzalez-Gutierrez J.L., Varela-De-Seijas E. Bihemispheric contribution to motor recovery after stroke: a longitudinal study with transcranial doppler ultrasonography // Cerebrovasc. Dis. 1999; 9, 337-344.
18. Davalos A., Castillo J., Alvarez-Sabin J., Secades J.J., Mercadal J., Lopez S., Cobo E., Warach S., Sherman D., Clark W.M., Lozano R. Oral citicoline in acute ischemic stroke. An individual patient data pooling analysis of clinical trials // Stroke 2002; 33, 2850-2857.
19. Dijkhuizen R.M., Ren J., Mandeville J.B., Wu O., Ozdag F.M., Moskowitz M.A., Rosen B.R., Finklestein S.P. Functional magnetic resonance imaging of reorganization in rat brain after stroke // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98, 12766-12771.
20. Dijkhuizen R.M., Singhal A.B., Mandeville J.B., Wu O., Halpern E.F., Finklestein S.P., Rosen B.R., Lo E.H. Correlation between brain reorganization, ischemic damage, and neurologic status after transient focal cerebral ischemia in rats: a functional magnetic resonance imaging study // J. Neurosci. 2003; 23, 510-517.
21. Duncan P.W., Goldstein L.B., Matchar D., Divine G.W., Feussner J. Measurement of motor recovery after stroke: outcome assessment and sample size requirements // Stroke 1992; 23, 1084-1089.
22. Feydy A., Carlier R., Roby-Brami A., Bussel B., Cazalis F., Pierot L., Burnod Y., Maier M.A. Longitudinal study of motor recovery after stroke: recruitment and focusing on brain activation // Stroke 2002; 33, 1610-1617.
23. Gabbott P.L., Warner T.A., Jays P.R., Salway P., Busby S.J. Prefrontal cortex in the rat: projections to subcortical autonomic, motor, and limbic centers // J. Comp. Neurol. 2005; 492, 145-177.
24. Gerfen C.R. The neostriatal mosaic: striatal patch-matrix organization is related to cortical lamination // Science 1989; 246, 385-388.
25. Gibb R., Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain // J. Neurosci. Methods 1998; 79, 1-4.
26. Glaser E.M., Van der Loos H. Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain // J. Neurosci. Methods 1981; 4, 117-125.
27. Hallett M. Plasticity of the human motor cortex and recovery from stroke // Brain Res. Brain Res. Rev. 2001; 36, 169-174.
28. Hankey G.J., Jamrozik K., Broadhurst R.J., Forbes S., Anderson C.S. Long-term disability after first-ever stroke and related prognostic factors in the perth community stroke study, 1989-1990 // Stroke 2002; 33, 1034-1040.
29. Hurtado O., Moro M.A., Cardenas A., Sanchez V., Fernandez-Tome P., Leza J.C., Lorenzo P., Secades J.J., Lozano R., Davalos A., Castillo J., Lizasoain I. Neuroprotection afforded by prior citicoline administration in experimental brain ischemia: effects on glutamate transport // Neurobiol. Dis. 2005; 18, 336-345.
30. Ishibashi S., Kuroiwa T., Endo S., Okeda R., Hidehiro M. Neurological dysfunctions versus regional infarction volume after focal ischemia in mongolian gerbils // Stroke 2003; 34, 1501-1506.
31. Johansson B.B. Brain plasticity and stroke rehabilitation. The Willis lecture // Stroke 2000; 31, 223-230.
32. Jones T.A., Schallert T. Use-dependent growth of pyramidal neurons after neocortical damage // J. Neurosci. 1994; 14, 2140-2152.
33. Jones T.A., Chu C.J., Grande L.A., Gregory A.D. Motor skills training enhances lesion-induced structural plasticity in the motor cortex of adult rats // J. Neurosci. 1999; 19, 10153-10163.
34. Kawamata T., Ren J., Chan T.C., Charette M., Finklestein S.P. Intracisternal osteogenic protein-1 enhances functional recovery following focal stroke // NeuroReport 1998; 9, 1441-1445.
35. Kolb B., Cote S., Ribeiro-da-Silva A., Cuello C. Nerve growth factor treatment prevents dendritic atrophy and promotes recovery of function after cortical injury // Neuroscience 1996; 76, 1139-1151.
36. Kolb B., Stewart J., Sutherland R.J. Recovery of function is associated with increased spine density in cortical pyramidal cells after frontal lesions and/or noradrenaline depletion in neonatal rats // Behav. Brain Res. 1997; 89, 61-70.
37. Lashley K.S. Studies of cerebral function in learning: V. The retention of motor habits after destruction of the so-called motor areas in primates // Arch. Neurol. Psychiatry 1924; 12, 249-276.
38. Lee R.G., van Donkelaar P. Mechanisms underlying functio nal recovery following stroke // Can. J. Neurol. Sci. 1995; 22, 257-263.
39. Luke L.M., Allred R.P., Jones T.A. Unilateral ischemic sensori-motor cortical damage induces contralesional synaptogenesis and enhances skilled reaching with the ipsilateral forelimb in adult male rats // Synapse 2004; 54, 87-199.
40. Marshall R.S., Perera G.M., Lazar R.M., Krakauer J.W., Constantine R.C., DeLaPaz R.L. Evolution of cortical activation during recovery from corticospinal tract infarction // Stroke 2000; 31, 656-661.
41. Mattson M.P. Modification of ion homeostasis by lipid peroxidation: roles in neuronal degeneration and adaptive plasticity // Trends Neurosci. 1998; 21, 53-57.
42. Mervis R.F., Pope D., Lewis R., Dvorak R.M., Williams L.R. Exogenous nerve growth factor reverses age-related structural changes in neocortical neurons in the aging rat. A quantitative Golgi study // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1991; 640, 95-101.
43. Montoya C.P., Campbell-Hope L.J., Pemberton K.D., Dunnet S.B. The staircase test: a measure of independent forelimb reach ing and grasping abilities in rats // J. Neurosci. Methods 1991; 36, 219-228.
44. Neafsey E.J., Bold E.L., Haas G., Hurley-Gius K.M., Quirk G., Sievert C.F., Terreberry R.R. The organization of the rat motor cortex: a microstimulation mapping study // Brain Res. 1986; 396, 77-96.
45. Nelles G. Cortical reorganization - effects of intensive therapy // Restor. Neurol. Neurosci. 2004; 22, 239-244.
46. Nelles G., Spiekermann G., Jueptner M., Leonhardt G., Müller S., Gerhard H., Diener C. Reorganization of sensory and motor systems in hemiplegic stroke patients. A positron emission tomography study // Stroke 1999; 30, 1510-1516.
47. Page S.J., Levine P., Leonard A.C. Modified constraint-induced therapy in acute stroke: a randomized controlled pilot study // Neurorehabilitation Neural Repair 2005; 19, 27-32.
48. Papadopoulos C.M., Tsai S.Y., Cheatwood J.L., Bollnow M.R., Kolb B.E., Schwab M.E., Kartje G.L. Dendritic plasticity in the adult rat following middle cerebral artery occlusion and Nogo-a neutralization // Cereb. Cortex 2006; 16, 529-536.
49. Patt S., Cervos-Navarro J., Stoltenburg-Didinger G., Schreiner C. The effects of CDP-choline on newborn rat pups with experimental alcohol fetopathy. A Golgi study // Histol. Histopathol. 1989; 4, 429-434.
50. Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in Stereoataxic Coordinates. - Compact 3rd ed. - San Diego: Academic Press, 1997.
51. Rejdak K., Rejdak R., Sieklucka-Dziuba M., Stelmasiak Z., Griebd P. The effects of citicoline and/or MK-801 on survival, neurological and behavioral outcome of mice exposed to transient hyperglycemia and oligemic hypoxia // Eur. Neuropsychopharmacol. 2001; 11, 333-341.
52. Richardson U.I., Watkins C.J., Pierre C., Ulus I.H., Wurtman R.J. Stimulation of CDP-choline synthesis by uridine or cytidine in PC12 rat pheochromocytoma cells // Brain Res. 2003; 971, 161-167.
53. Scheidtmann K. Advances in adjuvant pharmacotherapy for motor rehabilitation: effects of levodopa // Restor. Neurol. Neurosci. 2004; 22, 393-398.
54. Seil F.J. Recovery and repair issues after stroke from the scientific perspective // Curr. Opin. Neurol. 1997; 10, 49-51.
55. Steinberg B.A., Augustine J.R. Behavioral, anatomical, and physiological aspects of recovery of motor function following stroke // Brain Res. Rev. 1997; 5, 125-132.
56. Stroemer R.P., Kent T.A., Hulsebosch C.E. Enhanced neocortical neural sprouting, synaptogenesis, and behavioral recovery with D-amphetamine therapy after neocortical infarction in rats // Stroke 1998; 29, 2381-2395.
57. Tarkka I.M., Pitkanen K., Sivenius J. Paretic hand rehabilitation with constraint-induced movement therapy after stroke // Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2005; 84, 501-505.
58. Tolwani R.J., Buckmaster P.S., Varma S., Cosgaya J.M., Wu Y., Suri C., Shooter E.M. BDNF overexpression increases den-drite complexity in hippocampal dentate gyrus // Neuroscience 2002; 114, 795-805.
59. Travis A.M., Woolsey C.N. Motor performance of monkeys after bilateral partial or total cerebral decortication // Am. Phys. Med. 1956; 35, 273-310.
60. Trovarelli G., Palmerini C.A., Floridi A., Piccinin G.L., Porcellati G. The transport of cytidine into rat brain in vivo, and its conversion into cytidine metabolites // Neurochem. Res. 1982; 7, 1199-1207.
61. Vendrame M., Cassady J., Newcomb J., Butler T., Pennypacker K.R., Zigova T., Sanberg C.D., Sanberg P.R., Willing A.E. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume // Stroke 2004; 35, 2390-2395.
62. Wang L., Pooler A.M., Albrecht M.A., Wurtman R.J. Dietary uridine- 5 -monophosphate supplementation increases potassium-evoked dopamine release and promotes neurite outgrowth in aged rats // J. Mol. Neurosci. 2005; 27, 137-145.
63. Wiessner C., Bareyre F., Allegrini P.R., Mir A.K., Frentzel S., Zurini M., Schnell L., Oertle T., Schwab M.E. Anti-nogo A antibody infusion 24 hours after experimental stroke improved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003; 23, 154-165.
64. Zhao C.S., Puurunen K., Schallert T., Sivenius J., Jolkkonen J. Behavioral and histological effects of chronic antipsychotic and antidepressant drug treatment in aged rats with focal ischemic brain injury // Behav. Brain Res. 2005; 158, 211-220.