Современные аспекты особенностей диагностики лямблиоза

Агафонова Е.В., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Куликов С.Н.

Актуальность проблемы

Лямблиоз - достаточно распространенное заболевание в мире [1], в Российской Федерации регистрируется более 130 тысяч случаев лямблиоза в год. Из них 70% составляют дети в возрасте до 14 лет [2]. Эта цифра может колебаться в большую или меньшую сторону в зависимости от санитарно-бытовых условий, возможностей диагностики и настороженности врачей по поводу данной паразитарной инвазии [3]. Актуальность лямблиоза определяется также и тем, что его клинические проявления часто маскируются различными вариантами гастроэнтерологической патологии, синдромами избыточного роста кишечной флоры, мальабсорбции, поливитаминной недостаточности, а также развитием аллергических заболеваний - рецидивирующей крапивницей, атопическим дерматитом, гастроинтестинальной формой пищевой аллергии, которые без адекватной противолямблиозной терапии приобретают рецидивирующее течение [3,4]. Данное заболевание может отягощать сопутствующие заболевания желудочно-кишечного тракта, приводя к развитию синдрома мальабсорбции и длительной диареи [1,5]. Наиболее подвержены заболеванию дети. В России у детей в возрасте до 2 лет в организованных коллективах пораженность лямблиозом составляет 34,5%, а в 3-4 года - до 70%, в среднем у детей младшего возраста в организованных коллективах лямблиоз выявляют в 9,3% случаев и в 0,9% - у воспитываемых в домашних условиях [6]. Наиболее эндемичным регионом по лямблиозу в мире является Экваториальная Африка [7]. В этих регионах у детей инфицированность лямблиями впервые регистрируется после 3-4 месяцев по появлению в крови специфических IgМ-антител, а в возрасте 8 месяцев примерно у 80% детей выявляются диагностические титры специфических противолямблиозных IgM-антител [8]. Передача инфекции чаще реализуется водным путем, реже - через продукты питания. Диагностика лямблиоза является трудной задачей: у некоторых больных с длительнотекущим лямблиозом антитела в сыворотке крови могут отсутствовать, что свидетельствует о неэффективности механизмов гуморальной защиты [9]. Антитела часто отсутствуют у страдающих лямблиозом детей с лимфатическим типом конституции; распространение практики постановки диагноза лямблиоза без проведения копрологического исследования нельзя считать оправданным.

Впервые лямблии были обнаружены Левенгуком (Leeuwenhoek) у больного с жидким стулом, и уже позже, в 1859 г. были описаны Д.Ф. Лямблем как возбудитель лямблиоза. Несмотря на давнюю историю изучения и важное медицинское значение, многие стороны патогенеза лямблиозной инвазии и биологии возбудителя остаются нераскрытыми [2,3]. Так, до сих пор является загадкой, как вегетативные формы лямблий (трофозоиты) являясь неинвазивными патогенами, не выделяя известных токсинов, способны вызывать длительную диарею. Не менее интересна и биология лямблий, позволяющая им выживать и колонизировать достаточно агрессивную среду тонкой кишки, преодолевая местные факторы защиты. Поразительным остается также и факт бессимптомного носительства лямблий у половины инфицированных [7,10]. В связи с этим в этой работе представлены современные данные, касающиеся проблем диагностики и особенностей иммунного ответа у инфицированных.

На основе морфологических исследований выделяют три вида лямблий: G. lamblia, G. muris и G. agilis [11]. Патогенной для человека и большинства млекопитающих считается только G. lamblia. Доказательств того, что два других вида могут вызывать заболевания у людей, нет. G. muris инфицирует главным образом грызунов, птиц и рептилий, а G. agilis найдена только у амфибий.

Особенности иммунного ответа при лямблиозе

В экспериментальных и клинических наблюдениях показано, что при заражении лямблиями в организме человека развиваются ответные иммунные реакции у большинства инфицированных и в последующем происходит самопроизвольная санация, даже в отсутствие противолямблиозной терапии [10]. Кроме того, было отмечено, что у лиц проживающих в районах, эндемичных по лямблиозу, наблюдается большая устойчивость к вторичному заражению [3]. Приобретенный иммунитет против лямблий является не завершенным, и часто особенно у детей развиваются повторные эпизоды инфекции. Дети до 6 лет, в связи с незрелостью иммунной системы являются более восприимчивыми к инфекции, чем взрослые и подростки. Взрослые становятся особо восприимчивыми к лямблиозной инфекции только при развитии выраженного иммунодефицита [3,7,12]. В формировании противолямблиозного иммунитета основную роль играют клеточные механизмы. Кооперация В-лимфоцитов, продуцирующих IgA, и Т-лимфоцитов-хелперов (CD4+) необходима для контроля над данной инфекцией [13-15]. У пациентов с выраженным иммунодефицитом, связанным с дефектами в Т- и В-клеточном звене, повышается восприимчивость к лямблиозной инфекции и наблюдается большое ее распространение [12]. Отмечено, что пациенты с клеточным иммунодефицитом более восприимчивы к инфекции, чем пациенты, имеющие избирательный дефицит IgA [12]. Антилямблиозные секреторные IgA играют важную роль в разрушении лямблий и санации кишечника, что было подтверждено целым рядом экспериментальных исследований [16]. Для других классов иммуноглобулинов (IgG, IgM) показан их цитотоксический эффект на лямблии и нарушение процессов инкапсулирования трофозоитов [3]. На продолжительность течения и тяжесть лямблиоза у человека влияет и состояние факторов местной неспецифической защиты кишечника. К ним относят в верхних отделах кишечника желчь и ее соли, слизь кишечника, а также целый ряд антимикробных веществ, образуемых клетками слизистой кишечника и содержащихся в пищеварительных секретах. Желчь обладает бактериостатическим действием, является мощным детергентом, а также ингибирует рост многих простейших. Желчь стимулирует цистообразование лямблий, а кишечная слизь способствует прикреплению лямблий к эпителию. К факторам, способным ингибировать рост лямблий в тонком кишечнике, относят ненасыщенные жирные кислоты, образуемые из триглицеридов пищи и особенно грудного молока (под действием липазы панкреатического сока или грудного молока при грудном вскармливании ребенка). Однако лямблии в силу колонизации верхних отделов, защищены от действия жирных кислот слизью и желчью. Более эффективными ингибиторами роста и развития лямблий в верхнем отделе кишечника являются секретируемые эпителием крипт кишечника белки дефензины [17]. Установлена способность кишечных эпителиоцитов, расположенных в области верхушек кишечной ворсинки, выделять NO и продукты распада окиси азота. Роль NO в контроле над инфекционными агентами, не вторгающимися в клетку, менее изучена. Как предполагают, продукты распада окиси азота или сама окись азота могут повреждать вегетативные формы лямблий, ингибировать инкапсулирование и выход из цисты вегетативных форм [4]. В процессе существования и эволюции лямблии оказались способными вырабатывать устойчивость к системе защиты энтероцитов, связанной с окисью азота. Они активно метаболизируют аргинин, тем самым лишая энтероциты необходимого субстрата для синтеза NO [4] и ослабляя важную систему защиты от инвазии энтеропатогенных возбудителей.

Диагностика лямблиоза

До сих пор наиболее часто применяемым тестом в лабораторной диагностике лямблиоза остается микроскопия осадочных компонентов фекалий или содержимого, полученного при дуоденальном зондировании с целью выявления цист лямблий. К сожалению, указанные тесты лабораторной диагностики лямблиоза обладают низкой чувствительностью, подвержены влиянию ряда субъективных и объективных факторов, среди которых такие, как непостоянное выделение цист при лямблиозе, трудность микроскопической идентификации, требование специальной подготовки персонала, занятого микроскопической диагностикой [18,19]. Основное ограничение микроскопического метода - его неспособность дифференцировать близко родственные разновидности, имеющие различное значение в патологии человека [20]. Суммируя данные литературы и собственный опыт для оптимизации копрологического исследования, мы использовали:

• 3-4-кратное исследование кала с различными интервалами (8-7 дней);
• исследование, по возможности, жидких фракций фекалий (прилежащей к тонкой кишке), собранных из 6-7 мест;
• исключение приема медикаментов перед исследованием на 5-7 дней в связи с возможностью повреждения морфологии цист;
• применение консервантов при невозможности доставки материала в лабораторию в течение короткого времени (в частности, оптимальным для исследования на лямблии является консервант Сафаралиева).

Перспективными способами лабораторной диагностики лямблиоза у человека сегодня остаются методы иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа (Методические указания МУ 3.2.1173-02: «Профилактика паразитарных заболеваний. Серологические методы лабораторной диагностики паразитарных заболеваний»). Они позволяют выявлять антигены данных возбудителей в пробах фекалий и в сыворотке крови больных и носителей [21-23]. С этой целью используют коммерческие иммуноферментные и иммунохроматографические тест-системы, выявляющие специфические антитела в сыворотке крови и антигены в фекалиях [24] Они обладают большей чувствительностью (66,3-98,9%) и высокой специфичностью (92,6%) в отличие от рутинных микроскопических методов в диагностике лямблиоза. За рубежом сконструированы ряд диагностических ИФА тест-систем, работающих на выявление специфических противолямблиозных секреторных антител в слюне. Данные тест-системы прошли успешную апробацию и могут быть рекомендованы для использования в лабораторной диагностике лямблиоза [25]. Тест-системы выявляют специфические суммарные иммуноглобулины (IgG, A, M), которые представлены по вкладу в оптическую плотность преимущественно IgG антител, а также специфические иммуноглобулины класса IgM. Используемый коэффициент позитивности позволяет оценивать степень инвазии, а также проводить оценку эффективности антилямблиозной терапии. Суммируя данные, повышенный уровень IgG антител отражает наличие хронического лямблиоза или начало стадии реконвалесценции острого лямблиоза (в сочетании с наличием IgM антител). Наличие только IgМ антител в зависимости от коэффициента позитивности отражает наличие острого лямблиоза при инвазии различной степени выраженности (те же авторы). Для более эффективного использования лабораторных тестов необходима разработка дифференциально-диагностических алгоритмов для рационального использования тест-систем. Параллельное использование копрологических и серологических методов диагностики позволяют более надежно и эффективно выявлять лямблиоз. Опыт использования комплексной диагностики лямблиоза на базе поликлиники Казанского НИИЭМ позволил нам разработать алгоритм диагностики лямблиоза, учитывающий данные копрологического и серологического исследования.

Серологическое обследование лиц с аллергическими заболеваниями показало, что у 63,8% больных был выявлен повышенный уровень антител к антигенам лямблий в сыворотке крови (серопозитивные лица). При этом 16% больных имели повышенный уровень IgМ антител, наличие которых является признаком активного заболевания, из них у 4,8% больных цисты не были выявлены, у 8,9% повышенный уровень IgM антител сочетался с наличием антител класса IgG, что мы расценивали, как реактивацию или реинфицирование при массивной инвазии. У 46,8% больных имел место повышенный уровень IgG антител в сыворотке крови. При этом доля больных с отрицательным цистовыделением была более высокой в группе больных с низким коэффициентом позитивности (от 1,0 до 2,0) по сравнению с больными с высоким коэффициентом позитивности - >2,0 (10,5 против 14,5). Таким образом, частота отрицательного цистовыделения связана с уровнем инфицированности, определяемым по наличию IgG антител.

Особую группу составили серонегативные больные с наличием цистовыделения, что объясняется, во-первых, наличием иммунодефицита, когда иммунная система не способна нарабатывать антитела в достаточном количестве, даже при наличии активной лямблиозной инфекции. Особенно часто такая ситуация имеет место у детей при транзиторной младенческой гипогаммаглобулинемии. Во-вторых, может отсутствовать транслокация антигенов лямблий через кишечную стенку при невысокой степени инвазии и сохранности местного иммунитета [12]. В любом случае данный вариант требует индивидуального подхода как к диагностике, так и к лечению лямблиоза. Рекомендуемый нами алгоритм позволяет избежать ненужных многократных исследований, оперативно устанавливать диагноз лямблиозной инфекции и активность процесса.

Литература
1. Katelaris P.H., Farthing M.J.G. / Diarrhea and malabsorption in Giardiasis: A multifactorial process // Gut 1992. V.33. P.295-297.
2. Gillin F.D., Reiner D.S., . McCaffery J.M. / Cell biology of the primitive eukaryote Giardia lambli // Annual Rev. Microbiol. 1996. V.50 P.679-705.
3. Faubert G. / Immune response to Giardia duodenali. // Clin. Microbiol. Rev. 2000. V.13. P.35-54.
4. Eckmann L., Laurent F., Langford T.D., Hetsko M.L., Smith J.R., Kagnoff M.F., Gillin FD. / Nitric oxide production by human intestinal epithelial cells and competition for arginine as potential determinants of host defense against the lumen-dwelling pathogen Giardia lamblia // J. Immunol. 2000. V.164. P.1478-1487.
5. Buret A., Hardin J.A., Olson M.E., Gall D.G. / Pathophysiology of small intestinal malabsorption in gerbils infected with Giardia lamblia // Gastroenterol. 1992. V.103. P.506-513.
6. Руководство по инфекционным болезням у детей. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999.-824 с.
7. Adam R.D. / The biology of Giardia spp. // Microbiol. Rev. 1991. V.55. P.706-732.
8. Lunn P.G., Erinoso H.O., Northrop-Clewes C.A., Boyce S.A. / Giardia intestinalis is unlikely to be a major cause of the poor growth of rural gambian infants // J. Nutrit. 1999. V.129. P.872-877.
9. Сергиев В. П., Лобзин Ю. В. и др. Паразитарные болезни человека (протозоозы и гельминтозы). - С.-Петербург, «Фолиант», 2006. - С. 2 - 444.
10. Nash T.E., Herrington D.A., Losonsky G.A., Levine M.M. / Experimental human infections with Giardia lamblia // J. Infect. Dis. 1987. V.156. P.974-984.
11. Flanagan P.A. // Epidemiol. Infect. 1992. V.109. P.1-22.
12. Lai P.S., Mayer L. / Gastrointestinal manifestations of primary immunodeficiency disorders // Semin. Gastrointest. Dis. 1997. V.8. P.22-32.
13. Heyworth M.F., Carlson J.R., Ermak T.H. / Clearance of Giardia muris infection requires helperinducer T lymphocytes // J. Exp. Med. 1987. V.165. P.1743-1748.
14. Snider D.P., Gordon J., McDermott M.R., Underdown B.J. / Chronic Giardia muris infection in anti-IgM-treated mice. I. Analysis of immunoglobulin and parasite-specific antibody in normal and immunoglobulin-deficient animals. // J. Immunol. 1985. V.134. P.4153-4162.
15. Stager S., Muller N. / Giardia lamblia infections in B-cell-deficient transgenic mice. // Infect. Immun. 1997. V.65. P.3944-3946.
16. Langford T.D, Housley M.P., Boes M., Chen J., Kagnoff M.F., Gillin F.D., Eckmann L. / Central importance of immunoglobulin A in host defense against Giardia spp. // Infect. Immun. 2002. V.70. P.11-18.
17. Aley S.B., Zimmerman M., Hetsko M., Selsted M.E., Gillin F.D. / Killing of Giardia lamblia by cryptidins and cationic neutrophil peptides // Infect. Immun. 1994. V.62. P.5397-5403.
18. Tanyuksel M., Petri W.A. / Laboratory diagnosis of amebiasis. // Clin. Microbiol. Rev. 2003. V.16. P.713-729.
19. Marshall M.M., Naumovitz D., Ortega Y.,. Sterling C.R. / Waterborne protozoan pathogens // Clin. Microbiol. Rev. 1997.V.10. P.67-85.
20. Morgan U.M., Deplazes P., Forbes D.A., Spano F., Hertzberg H., Sargent K. D., Elliot A., Thompson R.C. / Sequence and PCR-RFLP analysis of the internal transcribed spacers of the rDNA repeat unit in isolates of Cryptosporidium from different hosts. // Parasitology. 1999. V.118. P.49-58.
21. Aldeen W.E., Carroll K., Robison A., Morrison M., Hale D. / Comparison of nine commercially available enzyme-linked immunosorbent assays for detection of Giardia lamblia in fecal specimens. // J. Clin. Microbiol. 1998. V.36. P.1339-1340.
22. Garcia L.S., Shimizu R.Y. / Evaluation of nine immunoassay kits (enzyme immunoassay and direct fluorescence) for detection of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum in human fecal specimens. // J. Clin. Microbiol. 1997. V.35. P.1526-1529.
23. Garcia L.S., Shimizu R.Y., Bernard C.N. / Detection of Giardia lamblia, Entamoeba histolytica/dispar, and Cryptosporidium parvum antigens in human fecal specimens using the Triage parasite panel enzyme immunoassay. // J. Clin. Microbiol. 2000. V.38. P.3337-3340.
24 Лопатин Т.Н. Применение ИФА для диагностики. // Бюллетень Лабораторной Cлужбы. 2002. № 10.
25. Hasan S.M.T., Maachee M., Cуrdova O.M., Diaz de la Guardia R., Martins M., Osuna A. / Human secretory immune response to fatty acid-binding protein fraction from Giardia lamblia // Infect. Immun. 2002. V.70. P.2226-2229.