Химиотерапия туберкулеза и поиск новых лекарственных препаратов

Ю.О. САЗЫКИН

ММА им. И.М. Сеченова

В последние десятилетия принципиально новых (инновационных) противотуберкулезных препаратов не появилось. В то же время выяснилось, что туберкулезная палочка потенциально обладает особенно высокими приспособительными способностями к изменениям условий ее существования в организме человека. За 30-40 лет отступления туберкулеза его возбудитель успел измениться и сам перешел в наступление. Рассказывает проф. Государственного научного центра по антибиотикам ММА им. И.М. Сеченова Ю.О. САЗЫКИН.

В настоящее время в постоянном контакте с возбудителем туберкулеза находятся до 2 млрд человек, которые, таким образом, подвергаются риску развития активной формы болезни. Свыше 8 млн ежегодно заболевают. От 2 до 3 млн человек каждый год погибают от туберкулеза. По свидетельству зарубежной печати, особую тревогу в этом отношении вызывают страны Африки к югу от Сахары, где вспышки туберкулеза рассматриваются как следствие распространения СПИДа, и Средняя Азия, например Таджикистан, “ввиду деструкции там в постсоветское время системы медицинского сервиса”, — так пишет журнал Американской медицинской ассоциации (JAMA).

Успехи в лечении туберкулеза были достигнуты, начиная с середины ХХ века, прежде всего за счет химиотерапии. Подчеркивая это обстоятельство, мы остановимся затем на сегодняшних возникших перед химиотерапией трудностях.

В борьбе с туберкулезом потерпел на рубеже XIX-ХХ веков неудачу классик медицинской микробиологии Роберт Кох, использовавший методы иммунологии. “Средство Коха провалилось в России окончательно”, — писал русский врач Антон Павлович Чехов, трагедия которого заключалась не только в понимании опасности своего состояния как больного, но и в том, что до эпохи научной химиотерапии и антибиотиков он не мог знать того, что стало известно через полвека после его смерти и о чем образно сказал директор Института по изысканию новых антибиотиков РАМН Г.Ф. Гаузе, чье имя сейчас носит этот институт: “Чехов ходил по стрептомицину”. Действительно, почвенный микроорганизм — продуцент высокоэффективного противотуберкулезного антибиотика стрептомицина особенно часто обнаруживается в почвах Крыма, где провел последние годы жизни больной Чехов.

Именно со стрептомицина начинаются успехи в лечении туберкулеза путем прямого воздействия на туберкулезную палочку. История стрептомицина (вторая и пока единственная после пенициллина Нобелевская премия за антибиотик) не лишена интереса. Стрептомицин был открыт микробиологом, изучавшим почвенные биоценозы, на современной терминологии экологом, Ваксменом, переехавшим в юности в США из России. В его лаборатории была собрана и поддерживалась обширная коллекция почвенных многоклеточных бактерий — актиномицетов. Когда получил всемирную известность продукт зеленой плесени — пенициллин, было решено проверить на образование антибиотиков актиномицеты. Сразу же, казалось бы, повезло: вся лаборатория принялась изучать мощный антибиотик с широким спектром действия, которому дали название стрептотрицин. После двух лет работы его собрались передать в клинику — однако он оказался нефротоксичен. Пропал большой труд. Это грозило участникам работы депрессией. В этот момент, как вспоминал спустя двадцать лет член Национальной академии наук США лауреат Нобелевской премии Зелман Ваксман, ему пришла на память знаменитая надпись на знаменитом перстне его тезки — библейского царя: “И это пройдет”, т.е. не теряй головы от радости и не теряй присутствия духа при неудачах. Он достал следующую пробирку со следующей актиномицетной культурой. В ней оказался продуцент антибиотика, получившего название стрептомицин... В награду за силу воли технологию производства стрептомицина разрабатывать не пришлось: вся она — биосинтез, выделение, очистка — “уложилась” в готовую уже технологию стрептотрицина. “Парадоксальный случай, который, видимо, останется уникальным — технология препарата была разработана до его открытия”, — вспоминал об этом автор стрептомицина, оптимистически оценивая дальнейшие перспективы борьбы человечества с туберкулезом. Действительно, стрептомицин, открытый Ваксманом при моральной поддержке царя Соломона, сохранил жизнь миллионам больных туберкулезом. Однако это время прошло. Сейчас длительные режимы комплексной химиотерапии включают ряд равноценных ему и даже превосходящих его по значимости антимикробных агентов. В их число входят канамицин, кларитромицин — как и стрептомицин — ингибиторы функций бактериальных рибосом и потому синтеза белка; изониазид, этамбутол — ингибиторы ферментов, участвующих в синтезе полимеров клеточной стенки; ципрофлоксацин и другие фторхинолоны — ингибиторы функций ДНК — топоизомераз II и IV, т.е. репликации ДНК и других, связанных с ДНК процессов; рифамицины, воздействующие на РНК-полимеразу и, соответственно, на транскрипцию; пиразинамид, механизм действия которого недостаточно ясен. Для лечения туберкулеза, правда не столь часто, используются ингибитор синтеза пептидогликана D-циклосерин и ингибиторы синтеза белка виомицин и манамицин.

Несмотря на этот длинный перечень проблемы остаются и, более того, обостряются.

Борьбу с туберкулезом методами химиотерапии затрудняет ряд обстоятельств. Возбудитель туберкулеза размножается относительно медленно: поэтому нарушение его метаболизма химиотерапевтическим агентом проявляется не столь резко; клетки микобактерии вообще довольно легко переходят в фазу отсутствия роста с реактивацией через длительный срок — даже через несколько лет. Далее, затрудняет лечение туберкулеза частая внутриклеточная локализация патогена и высокая его концентрация в тканях и органах — например, на одно легкое у человека может приходиться до 10 млрд клеток M. tuberculosis. Все это было известно и ранее.

Недавно, однако, выяснились и новые особенности возбудителя туберкулеза. Когда туберкулезная микобактерия локализуется внутри животной клетки, у нее очень резко проявляется гипермутабельность. Активируется локус mut T ее хромосомы. При этом кроме мутаций, ведущих к антибиотикорезистентности, возникают так называемые компенсаторные мутации. В результате повышается, например, скорость роста (при сохранении резистентности); повышается вирулентность; повышается способность переносить дефицит некоторых метаболитов и неорганических ионов, которых мало в животных тканях.

Особо следует подчеркнуть такое повышающее вероятность возникновения резистентности обстоятельство, как однокопийность многих генов у туберкулезной бактерии. Это облегчает доминирование резистентности в случае мутации такого гена. Весь кодируемый однокопийным геном продукт, находящийся в клетке, становится индифферентным к антибиотику. Однокопийность генов системы белкового синтеза отличает возбудителя туберкулеза от, например, стафилококка и кишечной палочки, у которых по 2-3 копии генов этой системы, где, таким образом, рибосомы клетки при мутации только в одной копии гена оказываются смешанными — и чувствительными, и резистентными. Доминирует тогда чувствительный к антибиотику — например, к стрептомицину или кларитромицину — фенотип. Мутация же в единственной копии гена туберкулезной бактерии ведет к фенотипу резистентному.

Потребность в новых химиотерапевтических агентах для лечения туберкулеза, т.е. ингибиторах, нацеленных на новые мишени в туберкулезной бактерии, становится все более актуальной. Какие же направления их поиска предлагаются? Геном (совокупность генов) M. tuberculosis уже полностью секвенирован. Это значит, что определена последовательность нуклеотидов в каждом из примерно 4500 генов этого организма. Известны функции 70% генов. Потенциальными мишенями для новых антибактериальных агентов могут быть продукты остальных генов, т.е. ферменты и регуляторные белки, кодируемые этими генами, конечно, при условии жизненной важности таких продуктов для бактерии. Обращено внимание на поиск агентов, условно названных антимутаторами, подавляющих возможности мутации у бактерии, ведущих к антибиотикорезистентности. Особый интерес вызывают так называемые ivi гены: они не нужны бактерии при росте на обычных искусственных питательных средах, поэтому in vitro оказываются скрытыми. В то же время для выживания in vivo в тканях человека продукты их деятельности необходимы. Подавлять функции продуктов, кодируемых ivi генами, не единственная возможность использования информации об этих “скрытых” генах для создания новых противотуберкулезных препаратов.

Для борьбы с бактерией туберкулеза недавно предложено, например, принципиально по иному применить сведения о той биохимической системе, которую клетка образует для транспорта в свою цитоплазму необходимых ионов железа. Такая система абсолютно необходима бактерии при ее размножении in vivo, т.е. в тканях человеческого организма, когда клетка испытывает дефицит железа. В систему извлечения железа из среды с низкой его концентрацией и препровождения его в клетку входят два вида переносчиков (сидерофоров): гидрофильные, образующие комплекс с железом экзохелины, и липофильные, находящиеся в оболочке микобактерии переносчики — микобактины. Переходя от одного переносчика к другому, железо попадает наконец внутрь клетки в цитоплазму. Новая стратегия пополнения арсенала антибактериальных препаратов заключается в том, что переносчики железа предлагается сделать “векторными молекулами”, направленно транспортирующими в клетку не железо, или не только железо, но и те или иные ингибиторы метаболизма, лишенные антибактериальной активности только потому, что они не проникают через сложную и толстую оболочку микобактерии. Потенциальные антимикробные (в данном случае антибактериальные) вещества, перечень которых, в принципе, уже достаточно велик и может продолжать увеличиваться при отборе на бесклеточных ферментных системах, становятся, таким образом, основой лекарственных препаратов. Последнее требует, разумеется, отсутствия у них токсичности. Фактически здесь речь идет о создании молекул типа prodrugs — “пролекарств”: переносчик (сидерофор) — активное начало (антимикобактериальный агент); после доставки в клетку происходит их разделение за счет действия внутриклеточных ферментов. Антимикобактериальный агент проявляет свой эффект. Обнадеживает то обстоятельство, что микобактерия может использовать сидерофоры не только своего вида, но и ряда грибов и дрожжей, т.е. для конструирования пролекарств можно использовать сидерофоры разной структуры.

Еще один подход к созданию новых противотуберкулезных препаратов заключается в массовой проверке на активность сотен и тысяч веществ, как природного происхождения, так и синтетических, без особых теоретических предпосылок. Считается, что при таком просеивании всего нужные вещества не ускользнут от внимания. Национальный институт здоровья США и Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний выступили в 2001 г. с предложением присоединиться к выполнению выдвинутой ими “программы поиска новых лекарств для лечения туберкулеза”. Программа рассчитана именно на массовую проверку. В этом случае особенно важно силы и средства тратить рационально. Авторы программы учли частоту причин, по которым бракуются проверяемые препараты, и соответственно этому построили порядок тестирования. В каждом случае требуется максимальная стандартизация условий тестирования. Это касается сред, тест-объектов, т.е. штаммов возбудителя инфекции, культуры животных клеток, модельных биохимических систем.

Каждый потенциальный противотуберкулезный агент вначале испытывается в концентрации 6,25 мкг/мл на активность против M. tuberculosis Н37Rv, в среде ВАСТЕС 12В. Для оценки эффекта должны использоваться удобные при массовых операциях микроплаты со стандартным красителем. Проявившие активность соединения дополнительно тестируются также в стандартной радиометрической системе.

На следующем этапе определяется минимальная ингибирующая рост возбудителя туберкулеза концентрация каждого прошедшего предыдущий этап отбора соединения. Кроме того, в культуре клеток Vero оценивается их токсичность для животной ткани, вычисляется индекс избирательности. Для дальнейшего исследования отбираются соединения с определенной величиной этого индекса.

Дальнейший этап — оценка прошедших предыдущие этапы отбора соединений по активности против M. tuberculosis Н37Rv в инфицированных макрофагах костного мозга.

Последний этап отбора проводится на инфицированных мышах. Обязателен позитивный контроль (изониазид). Помимо нормальных мышей используются мыши, у которых в геноме отсутствует ген гамма-интерферона (т.е. с ослабленным врожденным иммунитетом). Авторы программы сообщают, что из 5000 проверявшихся ими веществ 9 прошли все этапы этого первичного отбора: они проходят сейчас предклинические испытания.

Исходные позиции, с которых ведется поиск новых противотуберкулезных препаратов, таким образом, разнообразны: от использования данных геномики применительно к возбудителю туберкулеза до попыток решать проблему за счет очень большого количества проверяемых веществ. При прогнозах на будущее не следует, однако, забывать известный тезис “наука непредсказуема”, тем более что он базируется на тезисе “науку не остановишь”.

Статья опубликована в журнале "Фармацевтический вестник"