Рівень неспецифічних гуморальних факторів імунітету в деякуляті здорових чоловіків

УДК 616.65-002.2-008.8-078.7

Драннік Г.М, Порошина Т.В., Добровольська Л.І.
ДУ "Інститут урології АМН України"

Для вирішення проблеми погіршення запліднюючої здатності еякуляту на хлі хронічного запалення передміхурової залози (ПЗ) потрібно враховувати значний перелік факторів, у тому числі секреторну здатність головної та додаткових статевих залоз продукувати неспецифічні гуморальні імунологічні фактори, їх кількісну та якісну характеристику. За даними літератури, в нормі їх продукція в еякулят може забезпечуватися імунокомпетентними клітинами, епітеліальними та стромальними клітинами простати, тестикулярними клітинами Лейдига, Сертолі, перетубулярними та епітеліальними клітинами придатків яєчок, сім’яних пухирців, залоз Купера [1, 11, 12]. Ефекти цих факторів спрямовані, у головному, на забезпечення фертильного потенціалу сперматозоїдів.

В зв’язку з цим, ціллю дослідження було визначення референтних значень цитокінів в еякуляті у здорових чоловіків з метою порівняння їх з показниками стандартнї спермограми.

Матеріали і методи дослідження

Імунологічні та сперматологічні досліждення еякуляту проведено у 20 практично здорових чоловіків репродуктивного віку (25 - 47 років), які проходили обстеження у відділенні сексопатології ДУ "Інститут урології АМН України" (зав. відділом д. мед. н., професор І. І. Горпинченко).

На теперішній час єдиним стандартним протоколом дослідження еякуляту є інструкція "Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью", 2001 рік видання. Макро- та мікроскопічне дослідження еякуляту було проведено згідно цього документа [2]. Всі маніпуляції з еякулятом проводили з дотриманням техніки безпеки як з потенційно інфікованим біологічним матеріалом.

Оцінювали показники спермограми, кожен з яких може істотно впливати на фертильні властивості еякуляту: кількість сперматозоїдів в 1 мл та в еякуляті, кількість живих та мертвих сперматозоїдів, рухливість (по 4 критеріях: а - швидкі поступальні рухи; b - повільні, в’ялі поступальні рухи; c - не поступальні рухи (коливальні або маятникоподібні, манежні); d - нерухливі сперматозоїди); патологічні форми та кількість лейкоцитів. Результати сперматологічного аналізу порівнювали з нормативними даними ВООЗ, які прийняті і в Україні.

Імунологічні показники в сім’яній плазмі визначали імуноферментним аналізом на напівавтоматичному аналізаторі STAT-Fax 303 Plus (США) з використанням тест-систем для кількісного визначення інтерлейкінів (IL) -6, IL-8, IL-17, IL-23, простатспецифічного антигену (PSA) виробництва "Укрмедсервіс", "Immundiagnostik" - секреторного імуноглобуліну А (sIgA), "Hycult biotechnology" - інгибітора секреторної лейкопротеази (SLPI), "Diaclone" - фактору некрозу пухлин - альфа (TNF-α), "DRG Instruments GmbH"- трансформуючого фактора росту - бета (TGF-β1), "Invitrogren" - ендотеліального фактора росту (VEGF).

Для отримання сім’яної плазми центрифугували еякулят протягом 10 хвилин при 1000 об/хв., після чого відбирали супернатант та центрифугували його ще 20 хвилин при 3000 об / хв. з метою видалення клітинних елементів та детриту. Середня величина коефіцієнту варіації при проведенні визначення одного зразку у трьох повторах < 10 %.

Отримані результати досліджень оброблені за допомогою програмного продукту "MedStat" (Україна) з використанням описових статистик та кореляційного аналізу [3].

Результати та їх обговорення.

Відомо, що еякулят є сумішшю секретів ПЗ (30 - 35 %), сім’яних пухирців (50 - 60 %), бульбоуретральних залоз та придатків яєчок (1 - 5 %) [5]. Тому дослідження еякуляту є найбільш важливими для з’ясування функціонального стану статевих залоз і запліднюючої здатності сперми.

Встановлено, що макро- і мікроскопічні показники еякуляту обстежених чоловіків відповідають нормативним вимогам ВООЗ, результати наведені в таблиці 1.

Таблиця 1
Показники еякуляту здорових чоловіків за результатами стандартного сперматологічного дослідження

Так, у пацієнтів обстеженої групи час розрідження еякуляту, його в’язкість, рН реакція, відсутність слизу (ознака запалення ПЗ), клітин ПЗ (при простатиті відбувається їх посилене злущування [4], відсутність аглютинації та агрегації сперматозоїдів відповідає нормативним (ВООЗ) показникам практично здорових фертильних чоловіків.

Лецитинові (ліпоїдні) зерна, які складаються з лецитину або близьких до нього фосфоліпідів і є продуктом нормальної фізіологічної секреції залозистого епітелію ПЗ [5, 6], були присутні в еякуляті всіх пацієнтів.

Зауважимо, що одним з основних критеріїв відбору пацієнтів була кількість лейкоцитів в еякуляті, яка не перевищувала нормативних показників - 1× 106 / мл сперми. Пов’язано це, насамперед, з тим, що лейкоцитоспермія є одним з основних показників гострого та латентного інфекційного запалення органів урогенітальної системи; у більшості інфертильних пацієнтів лейкоцитоспермія серед інших факторів впливу пов’язується з погіршенням та зниженням параметрів спермограми [7]. Даних щодо частоти визначення лейкоцитоспермії у здорових чоловіків з доказаною фертильністю практично не існує .

Відповідно до інструкції ВООЗ, до теперішнього часу нормальним вважається еякулят, в якому живих сперматозоїдів більше 75 %, а їх концентрація не менше 20 мл /мл еякуляту. У пацієнтів обстеженої групи ці показники також були в цих межах. Характерно, що останнім часом спостерігається тенденція до зниження концентрації сперматозоїдів у чоловіків у всьому світі. Так, дослідження сперми фертильних донорів в 60 незалежних центрах показали зниження концентрації сперматозоїдів з 1938 по 1990 рр. від 113 до 66 млн / мл. За даними Паризького банку сперми, в середньому концентрація сперматозоїдів падає на 2.6 % в рік [8].

Морфологія сперматозоїдів - один з ключових факторів в прогнозі фертильності. Поряд з концентрацією та рухливістю сперматозоїдів, їх морфологічна характеристика являє собою один з основних параметрів, що характеризує репродуктивну здатність сперми.

Згідно з інструкцією ВООЗ по семіологічним дослідженням, в еякуляті фертильних чоловіків повинно бути не менше 30 % морфологічно нормальних сперматозоїдів, а за суворими критеріями Крюгера - не менше 14%. У обстежених чоловіків їх кількість перевищувала нормативний мінімум.

Кількість прогресивно - рухливих сперматозоїдів у пацієнтів контрольної групи була також в межах норми (за даними ВООЗ - не меншою, ніж 50 %).

Таким чином, на підставі отриманих даних можна зробити висновок, що ознаки запалення статевих залоз та порушення запліднюючої здатності еякуляту у пацієнтів обстеженї групи не виявлені: показники спермограми, що характеризують функції головної та додаткових статевих залоз, були критерієм відсутності патологій, що впливають на їх фертильний потенціал. Слід підкреслити, що нормативним значенням кожного з показників спермограми вважаються таке, при якому можна надати позитивний прогноз фертильності, при цьому нормативні показники не визначають межі норми фертильності, так як чоловіки з нижчими показниками спермограми також можуть бути фертильними [9].

В табл. 2 представлено аналіз даних дослідження неспецифічних гуморальних імунних факторів в сім’яній плазмі цих же чоловіків. Досліджені параметри представлені у вигляді медіани, нижнього (25%) та верхнього (75%) квартиля. Медіана є характеристикою асиметричного розподілу даних; при значній асиметрії медіана краще середнього значення характеризує більшість даних. Квартилі характеризують ¼ частину загальної кількості даних після їх упорядкування від 0 до 100%.

В зв’язку з тим, що за результатами попереднього аналізу концентрація VEGF в еякуляті перевищує максимальні показники стандарту, його визначення проводили в сім’яній плазмі в розведенні 1:200, TGF-b1, відповідно, 1 : 5.

Таблиця 2
Референтні значення показників цитокінів, SLPI, sIgA та РSA в сім’яній плазмі здорових чоловіків

Встановлено, що в сім’яній плазмі практично здорових чоловіків знаходиться значна кількість SLPI, sIgA, цитокінів про- та протизапальної дії, біологічні ефекти яких на локальному рівні забезпечують фертильний потенціал еякуляту.

Проведений аналіз показав, що незв’язаний (вільний) TGF-β1 визначався у всіх пробах сім’яної плазми практично здорових чоловіків, його концентрація в середньому складала 375.5 пг/мл. TNF-α, біологічні ефекти якого здебільше протилежні TGF-β1, також присутній в еякуляті практично здорових чоловіків.

В нормі в еякуляті знаходиться значна кількість IL-8, хемоатрактанту для нейтрофілів.

Відсоток зразків сім’яної плазми, де присутній IL-17, складає 60%. Концентрація IL-17 в сім’яній плазмі здорових чоловіків за середніми даними у цих хворих дорівнює 11.6 пг/мл.

Концентрація IL-6 у в еякуляті чоловіків контрольної групи в середньому складала 26.2 пг/мл; IL-6 був присутній в сім’яній плазмі еякуляту в 100% випадків.

За результатами дослідження еякуляту встановлено, що в зразках сім’яної плазми у здорових чоловіків РSА присутній в 100 % випадків.

На сьогодні визнається, що сперматогенез залежить від багато- чисельних імунологічних факторів, що забезпечують інтеграцію та комунікацію різних типів клітин під час гормонального регулювання дозрівання зародкової клітини в яєчку. Механізми впливу цитокінів та інших імунних факторів в спермі на після - гонадному етапі сперматогенезу, у тому числі і на морфо-функціональні характеристики сперматозоїдів в еякуляті, не визначені.

В зв’язку з цим, подальший аналіз отриманих даних був проведений корелчційний аналіз між показниками локального імунітету і спермограми у практично здорових чоловіків.

Встановлено, що коливання показників SLPI, sIgA, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-17, IL-23, TGF-b1, VEGF, що спостерігається у практично здорових чоловіківне впливають на макро- і мікроскопічні характеристики еякуляту (р > 0.05).

Виходячи з отриманих даних, тільки концентрація PSA в еякуляті знаходиться у прямому кореляційному зв’язку (rS = 0. 09; р < 0, 05) з відсотком активно-рухливих сперматозоїдів (категорії а).

Таким чином, встановлено, що в еякуляті практично здорових чоловіків знаходиться значна кількість цитокінів та неспецифічних захисних протеінів, біологічні ефекти яких на локальному рівні забезпечують фертильний потенціал еякуляту. Індивідуальні коливання показників SLPI, sIgA, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-17, IL-23, TGF-b1, VEGF в еякуляті у практично здорових чоловіків не впливають на макро- і мікроскопічні характеристики сперматозоїдів еякуляту.

Список літератури.

1. MacLennan G.T. The influence of chronic inflammation in prostatic carcinogenesis: a 5-year followup study / G.T. MacLennan, R. Eisenberg, R.L. Fleshman, J.M. Taylor [et al.] // J. Urol. - 2006 (Sep.). - V. 176 (3). - Р. 1012 - 1016.
2. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью / Пер. с англ. ; под ред. Л. Ф. Курило. - М.: Издательство "Мед Пресс", 2001. - 144 с.
3. Лях Ю.М. Основы компьютерной биостатистики: анализ информации в биологии, медицине и фармации статистическим пакетом MedStat / Ю.М. Лях, В.Г.Гурьянов, В.Н. Хоменко, О.А. Панченко / Донецк: 2006, 211с.
4. Лабораторная диагностика мужского бесплодия / [Долгов В.В., Луговская С. А., Фанченко Н. Д. [и др.]; под ред. В. В. Долгова. - М.: Кафедра КЛД, 2005. - 196 с.
5. Имшенецкая Л. П. Мужское бесплодие / Л. П. Имшенецкая, В. И. Сажай, А. В. Сажай; под. ред. И. И. Горпинченко. - К.: Аврора плюс, 2005. - 84 с.
6. Молочков В. А. Хронический уретрогенный простатит / В. А. Молочков, И. И. Ильин. - М., 2004. - с.
7. Kraus W. Cellular and biochemical markers in semen indicating male accessory gland inflammation / W. Kraus, C. Bohring, A. Gueth [et al.] // Andrologia. - 2003. - V. 35, № 5. - P. 279 - 282.
8. Луньова Г. Г. Дослідження еякуляту в діагностиці чоловічого непліддя / Г. Г. Луньова, Г. М. Ліпкан, О. П. Завадецька [та інш.] - Київ, 2010. - с. 97.
9. Lackner J.E. Correlation of leukocytospermia with clinical infection and the positive effect of antiinflammatory treatment on semen quality // J. E. Lackner, R. Herwig, J. Schmidbauer, G. Schatzl [еt all.] // Fertil. Steril. - 2006. - V. 86. - P. 601 - 605.
10. Steiner G. E. Expression and function of pro-inflammatory interleukin IL-17 and IL-17 receptor in normal, benign hyperplastic and malignant prostate / G. E. Steiner, M. E. Newman, D. Paikl [et al.] // Prostate. - 2003. - V. 56. - Р. 171 - 182.
11. Steiner G. E. The Picture of the Prostatic Lymphokine Network Is Becoming Increasingly Complex / G. E. Steiner, B. Djavan, G. Kramer [et al.] // Rev. Urol. - 2007. - V. 4 (4). - Р. 171- 177.

РЕЗЮМЕ

УРОВЕНЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ИММУНИТЕТА В ЭКУЛЯТЕ ЗДОРОВЫХ МУЖЧИН

Дранник Г.Н., Порошина Т.В., Добровольская Л.И.
ДУ "Институт урологии АМН Украины"

Ключевые слова: хронический простатит, цитокины, спермотозоид.

Обобщены результаты исследования ELISA - методом на STAT-FAX 303 Plus концентраций sIgA, SLPI, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-17, IL-23, PSA TGF-β1, VEGF в семенной плазме 20 практически здоровых мужчин. На основании корреляционного анализа проанализирована их взаемосвязь с микро- и макроскопическими показателями эякулята. Обнаружена прямая корреляционная связь концентрации РSA в эякуляте и количества активно - подвижных сперматозоидов. Корреляционная связь концентраций SLPI, sIgA, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-17, IL-23, TGF-b1, VEGF в эякуляте с показателями спермограммы у здоровых мужчин отсутствует.