Оксид азота как маркер воспаления при стеатогепатите у больных с метаболическим синдромом

Звенигородская Л.А., Нилова Т.В.

Оксид азота (NO) в начале изучения связывали с воспалением. При воспалении макрофаги выделяют NO, который может ингибировать важные группы ферментов синтеза АТФ, ферменты цикла Кребса и синтеза ДНК. В организме NO образуется из аргинина с участием синтазы оксида азота [1,3,4,12].

Оксид азота, молекула со свойствами радикала, позволяет этому соединению как активировать свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их. Оксид азота относится к факторам антимикробной защиты организма. Он уничтожает множество типов патогенных микроорганизмов (вирусы, бактерии, грибы, простейшие) или останавливает их рост. Бактериальные продукты (токсины) индуцируют в макрофагах синтез ФНО, который индуцирует синтазу оксида азота. В макрофагах, нейтрофилах, гепатоцитах синтез оксида азота определяет индуцибельная синтаза оксида азота. В настоящее время NO-синтазы, специфичные для разных тканей и клеток, достаточно хорошо изучены [1,3-5,12]. Из гепатоцитов выделена и описана индуцибельная NO-синтаза [1]. Данная синтаза оксида азота имела уникальные свойства, характерные как для индуцибельных (индуцируется комбинацией факторов: интерлейкин-1, фактор некроза опухолей, интерферон и липополисахарид), так и для конститутивно экспрессируемых NO-синтаз, и является основой неспецифической резистентности организма. Оксид азота стимулирует синтез простагландинов за счет активации циклооксигеназ [5], усиливает антиоксидантную защиту, активируя продукцию глутатиона и супероксиддисмутазы [27]. Особый интерес представляет способность оксида азота экспрессировать синтез ряда важнейших белков и ферментов, белки антиоксидантной защиты, а также влиять на активность многих белков и ферментов - гуанилатциклазу, рибонуклеотидредуктазу, компонентов дыхательной цепи митохондрий и гликолиза, белков типа цитохрома Р450 [7]. Нитро- и другие азотсодержащие соединения метаболизируются до нитритов и нитратов, также могут вновь восстанавливаться до NO за счет наличия нитритредуктазной активности у гемсодержащих белков (гемоглобина, миоглобина, цитохромоксидазы, цитохрома Р450). Ферментной системой цитохром Р450 зависимых монооксигеназ микросом гепатоцита метаболизируются канцерогены, большинство лекарств и эндогенные субстраты, такие как холестерин, стероиды, простагландины, жирные кислоты. При заболеваниях печени подавляется активность гидроксилазы, то есть процесс цитохром Р450 зависимого гидроксилирования. Механизм угнетения цитохрома Р450 имеет свободнорадикальную природу.

Метаболический синдром, проявлениями которого являются абдоминальное ожирение, гиперлипидемия, артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, сахарный диабет 2 типа и тканевая инсулинорезистентность, приводит к патологическим изменениям в печени в 30% случаев: к жировой дистрофии печени - стеатозу или к жировой дистрофии печени с воспалением - стеатогепатиту [15-18].

Формирование стеатогепатита сопровождается воспалительно-некротическими изменениями в печени.

При избыточном бактериальном росте в кишечнике нарушаются процессы ферментативного гидролиза белков и синтеза витаминов, что приводит к дефициту белков, ферментов и коферментов, участвующих в синтезе липотротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), и как следствие - жир не выводится из гепатоцита, а накапливается в печени. Хронический эндогенный дефицит в клетках жирных кислот приводит к изменению жирнокислотного состава фосфолипидов и физико-химических свойств плазматических мембран клеток. Результатом этого являются нарушение активности Nа,К-АТФ-азы и снижение чувствительности к инсулину. Нарушение толерантности к глюкозе также является результатом этого процесса. При нарушении кишечного барьера в портальную систему печени поступают бактерии и их токсины, что приводит к развитию воспаления и некрозу гепатоцитов [18].

При кислородной недостаточности блокируются ферменты, участвующие в синтезе липопротеидов очень низкой плотности, которые являются транспортной системой выведения жира из гепатоцита. Свободные жирные кислоты (СЖК) являются субстратом перекисного окисления липидов, активация которого приводит к развитию стеатогепатита.

Новейшие достижения в области экспериментальных и клинических исследований указывают на тесную связь многих патологических состояний с процессом свободнорадикального окисления (СРО), который рассматривается как универсальный механизм повреждения клетки. Поскольку образование радикалов происходит преимущественно на мембранах клетки (в частности, гепатоцита), есть основания полагать, что воспалительная и некротическая активность и синдром цитолиза, выполняющих важную роль в повреждении печени, во многом обусловлены характером регуляции СРО.

Перекисное окисление липидов в печени может приводить к образованию потенциально токсичных промежуточных продуктов, которые могут вызвать воспалительные процессы в печени. Накопление свободных жирных кислот в гепатоцитах может приводить к набуханию митохондрий, повышенной склонности к их разрушению и усилению мембранной проницаемости, что, в свою очередь, может стать причиной повышения активности аминотрансфераз [15,18,23].

В эксперименте изучали роль эндотелиальной и индуцируемой форм синтазы оксида азота в повреждении печени в процессе ишемии и пришли к выводу, что синтаза оксида азота играет важную роль в защите клеток печени от повреждающего действия [24].

Целью настоящего исследования было изучение роли оксида азота в формировании воспаления при стеатогепатите с метаболическим синдромом.

Материал и методы

Было обследовано 90 больных стеатогепатитом с метаболическим синдромом. Верификацию диагноза больным проводили по данным клинических, биохимических, инструментальных методов исследования и морфологического анализа биопсийной ткани печени. Контрольную группу составили 20 здоровых доноров.

Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови определяли по методу Метельской В.А. (2005 г.). Скрининг-метод определения оксида азота достаточно точно отражает степень активности синтазы оксида азота по уровню метаболитов в сыворотке крови. После депротеинизации сыворотки крови с помощью этилового спирта и центрифугирования, уровень метаболитов (суммарную концентрацию нитратов и нитритов) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Восстановителем служил ванадия хлорид (Германия). При оценке эндогенного синтеза оксида азота прежде всего следует учитывать состав диеты. Кровь брали натощак после низконитратного ужина [7].

Актуальным представляется определение степени избыточной продукции оксида азота при различных патологических состояниях, сопровождающихся воспалением (в данном случае при стеатогепатите). Концентрация оксида азота будет отражать активность индуцибельной изоформы NO-синтазы.

Оценка степени воспаления и фиброза с помощью УЗИ затруднена и ненадежна [15], поэтому содержание оксида азота, как маркера воспалительной реакции, может служить дополнительным критерием оценки.

Результаты и обсуждение

Основой метаболического синдрома является нарушение структуры и функции клеточной мембраны, повреждаются сигнальная и транспортная системы, блокируется поступление в клетки глюкозы и жирных кислот. Биохимической основой метаболического синдрома является повышение в крови свободных насыщенных жирных кислот.

Индекс массы тела у больных стеатогепатитом превышал показатели нормы и был в 1-й группе в среднем 36,4 (увеличенный на 45,6%), во 2-й группе - 34,8 (увеличенный на 39,2%) и в 3-й группе - 31 (увеличенный на 24%).

Жировая ткань является источником биологически активных веществ, в том числе фактора некроза опухолей (ФНО), ключевого медиатора инсулинорезистентности, лептина-активатора окисления жирных кислот и др. [19]. При значительном увеличении массы жировой ткани развивается инсулинорезистентность. Имеются данные, что гипертрофированные адипоциты выделяют ИЛ-6, и его повышенный уровень может способствовать выработке фибриногена при висцеральном ожирении и диабете [29].

У всех больных стеатогепатитом с метаболическим синдромом выявлено достоверное повышение в плазме крови активности ферментов цитолиза и холестаза АЛТ и ACT, а также ГГТП. Показатели липидного спектра у обследуемых больных существенно изменялись: у всех было повышено общее содержание липидов, липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), триглицеридов (ТГ), а уровень липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) снижен. Уровень глюкозы был выше нормальных показателей почти в 2 раза и составлял 7,6 ммоль/л (норма 4,1-5,9 ммоль/л). Содержание холестерина повышено до 6,03 ммоль/л (норма 1,4-5,2 ммоль/л). ЛПНП: 4,8 (норма 2,3,0 ммоль/л). ЛПВП: 1,19 (норма 0,9-2,0 ммоль/л). ТГ: 2,03 (норма 0-1,7 ммоль/л). ACT: 82,9 (норма 5-35 Е/л). АЛТ: 97,5 (норма 5,5 Е/л).

Содержание стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови больных стеатогепатитом с метаболическим синдромом представлено в таблице 2. Согласно полученным данным у больных стеатогепатитом с метаболическим синдромом обнаружено достоверное повышение уровня метаболитов оксида азота в 1-й группе на 42% и составило в среднем 45,83±3,57 мкмоль/л (р<0,001), во 2-й группе на 69%, 54,4±4,33 мкмоль/л, и в 3-й группе на 45,8%, в среднем 46,9±4,77 мкмоль/л (р<0,001) по отношению к контролю. У больных стеатогепатитом с сопутствующей ИБС уровень метаболитов оксида азота был ниже, чем в группе без ИБС, что может быть связано с эндотелиальной дисфункцией.

Усиление синтеза оксида азота может играть важную роль в защите клеток печени от повреждающего действия токсических веществ. С другой стороны, избыток NO ухудшает функцию эндотелия, подавляет продукцию эндотелиального NO и угнетает сократительную функцию миокарда. Содержание метаболитов оксида азота в 3-й группе практически не отличалось от 1-й группы. По-видимому, у больных без сахарного диабета также имеются нарушения углеводного обмена, что подтверждается повышением уровня глюкозы в крови. При стеатозе печени содержание оксида азота не отличалось от контроля. Оксид азота является ключевым соединением в системе регуляции микроциркуляции и других жизненно важных процессов, таких как свертывание крови. Первичные медиаторы воспаления - цитокины формируют воспаление и инициируют синтез гепатоцитами комплекса вторичных медиаторов воспаления [8,21]. При гипергликемии и ожирении не только гепатоциты, но и адипоциты секретируют белки острой фазы воспаления. По литературным данным, при стеатогепатите в гепатоцитах синтезируются различные медиаторы воспаления, в том числе индуцибельная синтаза оксида азота; они секретируются из жировой ткани и регулируют чувствительность рецепторов к инсулину [19]. Характерной чертой воспаления является накопление нейтральных липидов: главным образом триглицеридов в цитозоле печеночных клеток. Воспаление и дефицит жирных кислот в большинстве клеток являются причиной того, что в клетках снижается синтез холестерина. У больных атеросклерозом изменяется характер взаимодействия липопротеидов крови и биомембран эндотелия сосудистой стенки, что способствует усиленному переходу холестерина в клетку. Образуются более вязкие мембраны, насыщенные холестерином.

Инфильтрация интимы кровеносных сосудов липидами происходит при каждом воспалительном процессе, независимо от этиологии. В первую очередь происходят нарушения в мембранных белках-транспортерах глюкозы, что приводит к развитию инсулинорезистентности. Дефицит в клетках жирных кислот моделирует высокий потенциал воспаления, гиперкоагуляции и различных осложнений [9]. В исследованиях отмечается, что у больных с умеренной гиперхолестеринемией повышается уровень оксида азота в крови до 56±7 мкмоль/л (в контроле 35±3 мкмоль/л) [5]. По данным других исследований, у больных с атерогенным стенозом внутренней сонной артерии также имеет место повышение уровня оксида азота до 33,0±2,9 мкмоль/л (норма 26,2±1,1 мкмоль/л) [6]. Существует тесная взаимосвязь между ожирением и дислипидемией, артериальной гипертонией, нарушенной толерантностью к глюкозе. Обнаружена связь массы жира в организме и его расположением в абдоминальной области с маркерами хронического воспаления. Данные, полученные нами СФ методом, согласуются с данными, полученными методом ВЖХ в группах здоровых доноров, больных сахарным диабетом и гипертонией, и показывают, что в образцах сыворотки крови уровень нитратов в группе здоровых доноров составляет 29,9±2,8 мкмоль/л, у больных СД - 58,6±6,9, а при АГ - 35,4±2,5 мкмоль/л [11].

У больных стеатогепатитом с метаболическим синдромом отмечается увеличение содержания метаболитов оксида азота, обусловленное повышением уровня липопротеидов низкой плотности, которые стимулируют активность индуцибельной синтазы оксида азота.

Биологические эффекты оксида азота определяются его биодоступностью, а также его содержанием, утилизацией в тканях или окислением при участии СР и модифицированных ЛПНП и других соединений. Как избыток, так и дефицит оксида азота неблагоприятен для организма. Высокие концентрации токсичны для клеток, ферментов, вызывают модификацию белков, повреждают нуклеиновые кислоты. Оксид азота и супероксидные радикалы регулируют окисление ЛПНП и приводят к их модификации [14,26]. По данным литературы, избыток оксида азота ингибирует белки-ферменты дыхательной цепи митохондрий и цикла Кребса, снижает синтез АТФ, что ведет к некрозу или апоптозу печеночных клеток.

Выводы

• У больных с метаболическим синдромом при стеатозе печени в результате отсутствия воспалительной реакции содержание метаболитов оксида азота не отличается от показателей контрольной группы.
• При стеатогепатите у больных с метаболическим синдромом отмечается усиление продукции оксида азота, более выраженное у больных без ИБС.
• Определение метаболитов оксида азота как маркера воспалительной реакции может служить дополнительным критерием оценки степени воспаления и прогнозирования течения стеатогепатита.

Литература
1. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия.
2000. Т. 65. Вып. 4. С. 485-503.
2. Журавлева И.А., Мелентьев И.А., Виноградов Н.А. Роль окиси азота в кардиологии и гастроэнтерологии // Клин. мед. 1997. Т. 75. № 4. С. 18-21.
3. Ковальчук Л.В., Хараева З.Ф. Роль оксида азота в иммунопатогенезе стафилококковых инфекций // Иммунология. 2003. № 3. С. 186-188.
4. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Сорос, образов, журнал. 2000. Т. 6. № 12. С. 27-34.
5. Манухина Е.Б., Дауни Х.Ф., Маллет Р.Т., Малышев И.Ю. Защитные и повреждающие эффекты периодической гипоксии: Роль оксида азота // Вестник Росс.
АМН. № 2. 2007. С. 25-33.
6. Голиков П.П., Леменев В.Л., Ахметов В.В. и др. Характер взаимосвязи оксида азота с ангиотензинпревращающим ферментом и малоновым диальдегидом у больных с атерогенным стенозом внутренней сонной артерии // Клин, медицина. № 7. 2004. С. 15-19.
7. Метельская В.А., Туманова Н.Г. Скриннинг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови // Клин, лаборат. диагн. № 6. 2005. С. 15-18.
8. Ольбинская Л.И., Игнатенко СБ. Роль системы цитокинов в патогенезе хронической сердечной недостаточности // Тер. архив. 2001. № 1. С. 82-84.
9. Титов В.Н. Оксид азота в реакции эндотелий зависимой вазодилатации. Основы единения эндотелия и гладкомышечных клеток в паракринной регуляции метаболизма. Клин, лабор. диагностика. № 2. 2007. С. 23-39.
10. Коробейникова Э.М., Кудревич Ю.В. Оценка состояния нитроксидергической вазорелаксации по содержанию нитратов в сыворотке крови больных ИБС // Клин, лабор. диагностика. № 10. 2001. С. 2-3.
11. Бондарь И.А., Климонтов В.В., Поршенников И.А. Оксид азота и диабетические ангиопатии. Сахарный диабет. 1999. № 4. С. 1-3.
12. Малышев И.Ю. Введение в биохимию оксида азота. Роль оксида азота в регуля¬ции основных систем организма // Росс, журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. № 1. 1997. С. 49-55.
13. Драпкина О.М., Задорожная О.О., Ивашкин В.Т., Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Особенности синтеза оксида азота у больных инфарктом миокарда // Клин, медицина. № 3. 2000. С. 19-23.
14. Груздева О.В. Способность липопротеинов низкой плотности к окислению и продукция кислорода и оксида азота мононуклеарными лейкоцитами больных инсулиннезависимым сахарным диабетом // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2001. Прил. 1.С. 21-22.
15. Подымова С.Д. Жировой гепатоз, неалкогольный стеатогепатит. Клинико-морфологические особенности. Прогноз. Лечение // МРЖ. Болезни органов пищеварения. Т. 7. № 2. 2005. С. 61-67.
16. Мельникова Н.В., Звенигородская Л.А., Хомерики С.Г., Овсянникова О.Н. Мето¬ды коррекции атерогенной дислипидемии у больных неалкогольным стеатогепатитом // МРЖ. Болезни органов пищеварения. Т. 8. № 2. 2006. С. 69-73.
17. Буеверов А.О., Богомолов П.О. Многофакторный генез жировой болезни печени // Гепатол. форум. Клинич. фармакология и терапия. 2006. № 3. С. 4-10.
18. Яковенко Э.П. Метаболические заболевания печени // Фарматека. № 10. 2003. С.31-39.
19. Корнеева О.Н., Драбкина О.М., Буеверов А.О., Ивашкин В.Т. Неалкогольная жи¬ровая болезнь печени как проявление метаболического синдрома. Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. № 4. 2005. С. 21-24.
20. Виноградов Н.А. Многоликая окись азота // Росс, журнал гастроэнт., гепат., колопроктол. № 2. 1997. С. 6-11.
21. Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Звенигородская Л.А., Лазебник Л.Б. Экспер. и
клин, гастроэнтер. № 1. 2007. С. 468.
22. Лазебник Л.Б., Дроздов В.Н., Барышников Е.Н. Роль NO в этиопатогенезе неко¬торых заболеваний органов пищеварения // Эксп. и клин, гастроэнт. № 2. 2005. С. 4-11.
23. Федоров И.Г., Никитин И.Г., Сторожаков Г.И. Неалкогольный стеатогепатит: клиника, патогенез, диагностика, лечение // Consilium mtdicum. 2004. V. 6. № 6. P. 401-405.
24. Kanaehi Shigeyki, Hines Jan N. // Nitric oxide synthase and postischemic liver injury // Biochem. And Biophys. Res. Commun. V. 200, 276, № 3. P. 851-854.
25. Minamiyama Yukiko. Isoforms of cytochrome P-450 on nitrate derived oxide release in Human Htart vesels // Febs. Wett. 1999. V. 452. № 3. P. 165-169.
26. Alison B. Nitric oxide regulation of free radical and enzymemediated lipid and lipoprotein oxidation // Ateriosclerosis, Thrombosis and Vase. Biol. 2000. V. 20. № 7. P. 1707-1715.
27. Moncada S. Nitric oxide and cell. Respiration Physiology and Patology. // Verk Kon. Acad. Genelsk Belg. 2000. V. 62. № 3. P. 171-179.
28. Lubrano V., Vassale С The effect of lipoproteins on endothelial nitric oxide synthase is modulated by lipoperoxides // Eur. J. Clin. Invest. 2003. V. 33. P. 117-125.
29. Festa Adostino R., Williams K., Karter A.I. The relation of body fat mass and distribution to markers of chronic inflammation // Int. J. Obesity. 2001. V. 25. № 10. P. 1407-1415.