Функциональный анализ микробиоценоза желудочно- кишечного тракта

Лоранская И.Д., Лаврентьева О.А.

История изучения состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) началась в 1681 г., когда голландский исследователь Антони Ван Левенгук впервые сообщил о своих наблюдениях относительно бактерий и других микроорганизмов, обнаруженных в человеческих фекалиях, и выдвинул гипотезу о совместном существовании различных видов бактерий в желудочно-кишечном тракте. В 1850 году Луи Пастер развил концепцию о функциональной роли бактерий в ферментационном процессе. Немецкий врач Роберт Кох продолжил исследования в данном направлении и создал методику выделения чистых культур, позволяющую идентифицировать специфичные бактериальные штаммы, что необходимо для разграничения болезнетворных и полезных микроорганизмов. В 1886 г. один из основоположников учения о кишечных инфекциях F. Esherich впервые описал кишечную палочку (Bacterium coli communae). Илья Ильич Мечников в 1888 году, работая в Институте Луи Пастера, утверждал, что в кишечнике человека обитает комплекс микроорганизмов, которые оказывают на организм "аутоинтоксикационный эффект", полагая, что введение в ЖКТ "здравословных" бактерий способно модифицировать действие кишечной микрофлоры и противодействовать интоксикации. Практическим воплощением идей Мечникова стало применение ацидофильных лактобацилл с терапевтическими целями, начатое в США в 1920-1922 годах. Отечественные исследователи приступили к изучению этого вопроса только в 50-х годах XX века. В 1955 г. Перетц Л.Г. показал, что кишечная палочка здоровых людей является одним из основных представителей нормальной микрофлоры и играет положительную роль благодаря сильным антагонистическим свойствам по отношению к патогенным микробам. Начатые более 300 лет назад исследования состава кишечного микробиоценоза, его нормальной и патологической физиологии и разработка способов положительного влияния на кишечную микрофлору продолжаются и в настоящее время.

Основными биотопами являются: желудочно-кишечный тракт (ротовая полость, желудок, тонкая кишка, толстая кишка), кожа, дыхательные пути, урогенитальная система.

Микрофлора ЖКТ является наиболее представительной, ее масса у взрослого человека составляет более 2,5 кг, численность - 1014. Ранее считалось, что в состав микробиоценоза ЖКТ входят 17 семейств, 45 родов, более 500 видов микроорганизмов. С учетом новых данных, полученных при исследовании микрофлоры различных биотопов ЖКТ с помощью молекулярно-генетических методов и метода газожидкостной хромато-масс-спектрометрии общий геном бактерий ЖКТ насчитывает 400 тыс. генов, что в 12 раз превышает размер генома человека. Подвергнута анализу на гомологию секвенированных генов 16S pРНК пристеночная (мукозная) микрофлора 400 различных отделов ЖКТ, полученная при эндоскопическом исследовании различных отделов кишечника добровольцев. В результате исследования показано, что пристеночная и просветная микрофлора включает 395 филогенетически обособленных групп микроорганизмов, из которых 244 являются абсолютно новыми. При этом 80% новых таксонов, выявленных при молекулярно-генетическом исследовании, относятся к некультивируемым микроорганизмам. Большинство из предполагаемых новых филотипов микроорганизмов являются представителями родов Firmicutes и Bacteroides. Общее количество видов приближается к 1500 и требует дальнейшего уточнения.

ЖКТ через систему сфинктеров сообщается с внешней средой окружающего нас мира и одновременно через кишечную стенку - с внутренней средой организма. Благодаря этой особенности в полости ЖКТ создалась собственная среда, которую можно разделить на две отдельные ниши: химус и слизистая оболочка. Пищеварительная система человека взаимодействует с различными бактериями, которые можно обозначить, как "эндотрофную микрофлору кишечного биотопа человека". Эндотрофная микрофлора человека делится на три основные группы. К первой группе относят полезную для человека эубиотическую индигенную или эубиотическую транзиторную микрофлору; ко второй - нейтральные микроорганизмы, постоянно или периодически высевающиеся из кишечника, но не влияющие на жизнедеятельность человека; к третьей - патогенные или потенциально патогенные бактерии ("агрессивные популяции"). В микроэкологическом плане желудочно-кишечный биотоп может быть разделен на ярусы (ротовая полость, желудок, отделы кишечника) и микробиотопы (полостной, пристеночный и эпителиальный). Способность к аппликации в пристеночном микробиотопе, т.е. гистадгезивность (свойство фиксироваться и колонизировать ткани) определяют суть транзиторности или индигенности бактерий. Эти признаки, а также принадлежность к эубиотической или агрессивной группе являются основными критериями, характеризующими взаимодействующий с ЖКТ микроорганизм. Эубиотические бактерии участвуют в создании колонизационной резистентности организма, что является уникальным механизмом системы противоинфекционных барьеров. Полостной микробиотоп на протяжении ЖКТ неоднороден, его свойства определяются составом и качеством содержимого того или иного яруса. Ярусы имеют свои анатомические и функциональные особенности, поэтому их содержимое различается по составу веществ, консистенции, рН, скорости перемещения и другим свойствам. Эти свойства определяют качественный и количественный состав адаптированных к ним полостных микробных популяций. Пристеночный микробиотоп является важнейшей структурой, ограничивающей внутреннюю среду организма от внешней. Он представлен слизистыми наложениями (слизистый гель, муциновый гель), гликокаликсом, расположенным над апикальной мембраной энтероцитов и поверхностью самой апикальной мембраны. Пристеночный микробиотоп представляет наибольший интерес с позиции бактериологии, так как именно в нем возникает полезное или вредное для человека взаимодействие с бактериями - то, что мы называем симбиозом. На сегодняшний день известно, что микрофлора слизистой оболочки кишечника существенно отличается от микрофлоры просвета кишечника и каловых масс. Хотя у каждого взрослого человека кишечник населяет определенная комбинация преобладающих видов бактерий, состав микрофлоры может меняться в зависимости от образа жизни, питания и возраста. Сравнительное исследование микрофлоры у взрослых лиц, состоящих в генетическом родстве той или иной степени, выявило, что на состав кишечной микрофлоры генетические факторы влияют больше, чем питание.

Рассмотрим композиции нормальной микрофлоры разных отделов ЖКТ. Ротовая полость и глотка осуществляют предварительную механическую и химическую обработку пищи и дают оценку бактериологической опасности относительно проникающих внутрь человеческого организма бактерий. Слюна является первой пищеварительной жидкостью, обрабатывающей пищевые вещества и воздействующей на проникающую микрофлору. Общее содержание бактерий в слюне вариабельно и в среднем составляет 108 МК/мл. В состав нормальной микрофлоры ротовой полости входят стрептококки, стафилококки, лактобациллы, коринебактерии, большое количество анаэробов. Всего микрофлора рта насчитывает более 200 видов микроорганизмов. На поверхности слизистой в зависимости от применяемых индивидуумом гигиенических средств обнаруживается около 103-105 МК/мм2. Колонизационную резистентность рта осуществляют преимущественно стрептококки (S. salivarus, S. mitis, S. mutans, S. sangius, S. viridans), а также представители кожного и кишечного биотопов. При этом S. salivarus, S. sangius, S. viridans хорошо прилипают к слизистой оболочке и зубному налету. Эти альфа-гемолитические стрептококки, обладающие высокой степенью гистадгезии, сдерживают колонизацию рта грибами рода Сandida и стафилококками. Микрофлора, транзиторно проходящая через пищевод, нестабильна, гистадгезивности к его стенкам не проявляет и характеризуется обилием временно находящихся видов, попадающих из полости рта и глотки. В желудке создаются относительно неблагоприятные условия для бактерий, обусловленные повышенной кислотностью, воздействием протеолитических ферментов, быстрой моторно-эвакуаторной функцией желудка и другими факторами, лимитирующих их рост и размножение. Здесь микроорганизмы содержатся в количестве, не превышающем 102-104 в 1 мл содержимого. Эубиотики в желудке осваивают в основном полостной биотоп, пристеночный микробиотоп для них менее доступен. Основными микроорганизмами, активными в желудочной среде, являются кислотоустойчивые представители рода Lactobacillus, обладающие или не обладающие гистадгезивным отношением к муцину, некоторые виды почвенных бактерий и бифидобактерии. Лактобациллы, несмотря на короткое время пребывания в желудке, способны, кроме антибиотического действия в полости желудка, временно колонизировать пристеночный микробиотоп. В результате совместного действия защитных компонентов основная масса попавших в желудок микроорганизмов погибает. Однако при нарушении работы слизистого и иммунобиологического компонентов некоторые бактерии находят в желудке свой биотоп. Так, за счет факторов патогенности в желудочной полости закрепляется популяция Helicobacter pylori.

К основным функциям тонкой кишки относят полостной и пристеночный гидролиз пищи, всасывание, секрецию, а также барьерно-защитную. В последней, кроме химических, ферментативных и механических факторов, значительную роль играет индигенная микрофлора тонкой кишки. Она принимает активное участие в полостном и пристеночном гидролизе, а также в процессах всасывания пищевых веществ. Тонкая кишка является одним из важнейших звеньев, обеспечивающих длительное сохранение эубиотической пристеночной микрофлоры. Существует разница в заселении эубиотической микрофлорой полостного и пристеночного микробиотопов, а также заселении ярусов по длине кишки. Полостной микробиотоп подвержен колебаниям по составу и концентрации микробных популяций, пристеночный микробиотоп имеет сравнительно стабильный гомеостаз. В толще слизистых наложений сохраняются популяции, обладающие гистадгезивными свойствами к муцину. Проксимальный отдел тонкой кишки в норме содержит относительно небольшое количество грамположительной флоры, состоящей главным образом из лактобацилл, стрептококков и грибов. Концентрация микроорганизмов составляет 102-104 на 1 мл кишечного содержимого. По мере приближения к дистальным отделам тонкой кишки общее количество бактерий возрастает до 108 на 1 мл содержимого, одновременно появляются дополнительные виды, включающие энтеробактерии, бактероиды, бифидобактерии.

Основными функциями толстой кишки являются резервирование и эвакуация химуса, остаточное переваривание пищи, выделение и всасывание воды, всасывание некоторых метаболитов, остаточного питательного субстрата, электролитов и газов, формирование и детоксикация каловых масс, регуляция их выделения, поддержание барьерно-защитных механизмов. Все перечисленные функции выполняются с участием кишечных эубиотических микроорганизмов. Количество микроорганизмов толстой кишки составляет 1010-1012 КоЕ на 1 мл содержимого. На бактерии приходится до 60% каловых масс. На протяжении всей жизни у здорового человека преобладают анаэробные виды бактерий (90-95% всего состава): бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, фузобактерии, эубактерии, вейллонеллы, пептострептококки, клостридии. От 5 до 10% микрофлоры толстой кишки составляют аэробные микроорганизмы: эшерихии, энтерококки, стафилококки, различные виды условно-патогенных энтеробактерий (протей, энтеробактер, цитробактер, серрации и др.), неферментирующие бактерии (псевдомонады, ацинетобактер), дрожжеподобные грибы рода Сandida и др. Анализируя видовой состав микробиоты толстой кишки, необходимо подчеркнуть, что в ее состав, помимо указанных анаэробных и аэробных микроорганизмов, входят представители непатогенных простейших родов и около 10 кишечных вирусов. Два различающихся по анатомо-физиологическим и экологическим характеристикам биотопа - тонкую и толстую кишку отделяет эффективно функционирующий барьер: баугиневая заслонка, которая открывается и закрывается, пропуская содержимое кишечника только в одном направлении, и удерживает обсемененность кишечной трубки в количествах, необходимых здоровому организму. Таким образом, хотя содержание бактерий во рту может быть достаточно высоким - до 106 КоЕ/мл, оно снижается до 0-10 КоЕ/мл в желудке, поднявшись на 101-103 в тощей кишке и 105-106 в дистальных отделах подвздошной кишки, с последующим резким возрастанием количества микробиоты в толстой кишке, достигая уровня 1012 КоЕ/мл в дистальных ее отделах. По мере продвижения содержимого внутри кишечной трубки снижается парциальное давление кислорода и повышается значение рН среды, в связи с чем появляется "этажность" расселения различных видов бактерий по вертикали: выше всего располагаются аэробы, ниже факультативные анаэробы и еще ниже - строгие анаэробы.

Доказано, что микрофлора может влиять на сенсомоторную функцию кишечника в трех направлениях:

• через конечные продукты бактериального брожения и метаболизма,
• нейроэндокринные факторы
• иммунные медиаторы.

Бактериальные пептиды стимулируют энтеральную нервную систему и афферентную иннервацию, а эндотоксины (липополисахариды) могут воздействовать на кишечную моторику. Продукты метаболизма сахаролитических бактерий - короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), такие как бутират, ацетат, пропионат, играют важную роль в поддержании нормальной функции кишечника и могут участвовать в патогенезе желудочно-кишечных заболеваний. КЖК являются важными источниками энергии, необходимыми для колоноцитов. Поддержание анаэробных условий в толстой кишке также осуществляется с помощью микробных метаболитов.

КЖК оказывают влияние на выработку серотонина, мотилина и соматостатина, содержащихся в энтероэндокринных клетках толстой кишки и подвздошной кишки; они являются ключевыми медиаторами кишечной моторики. Микрофлора имеет важное значение в нормальном развитии кишечной иммунной системы и лимфоидной ткани. Значение иммунной системы в регуляции сенсомоторной функции кишки также нельзя недооценивать.

Существуют гистохимические, морфологические, молекулярно-генетические методы исследования микроорганизмов, нагрузочные пробы.

Наиболее распространенным методом является бактериологическое исследование кала. Как правило, количество определяемых показателей колеблется от 14 до 25. Достоинством метода является точная верификация патогенных бактерий. К недостаткам метода относится возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов из-за неоднородности выделения микроорганизмов из разных отделов испражнений, трудности культивирования анаэробных микроорганизмов. Кроме того, определяется полостная и транзитная флора, которая доминирует в фекальной флоре, при этом пристеночная флора не оценивается.

Альтернативу бактериологическим исследованиям могут составить хроматографические методы дифференциации микроорганизмов - газожидкостная, ионнообменная и, в частности, газожидкостная хроматография (ГЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией (МС) - ГЖХ-МС. Метод ГЖХ-МС основан на определении компонентов бактериальных клеток, появляющихся в результате их естественного отмирания, или атаки компонентов иммунной системы. В качестве маркеров используют минорные липидные компоненты мембран микробов. По их содержанию и количеству можно в течение нескольких часов определить до 170 видов аэробных и анаэробных бактерий и грибов в разных биологических средах.

Разработан и внедряется в практику метод ГЖХ-анализа, основанный на определении КЖК, являющихся метаболитами в основном анаэробных родов микроорганизмов. На основании полученных данных создан метаболический паспорт при эубиозе кишечника. Метод позволяет достаточно быстро и достаточно точно оценить состояние индигенной микрофлоры.

Синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке (СИБР) предполагает аномальный рост (более 105 КОЕ/мл) эндогенных бактерий в тонкой кишке, сходных с теми, что в норме находятся в толстой кишке. Для диагностики СИБР применяют прямые и косвенные методы. Прямой заключается в посеве дуоденального и еюнального содержимого, полученного с помощью стерильного зонда. К косвенному методу можно отнести исследование выделяемого водорода - дыхательный тест. Обоснованием для создания водородного дыхательного теста стал факт того, что в процессе метаболизма углеводов микрофлорой толстой кишки образуется большое количество газов, в том числе водорода. Водородный тест может применяться для ориентировочного представления о степени бактериального обсеменения тонкой кишки. Однако в последнее время появилось мнение, что дыхательный водородный тест позволяет определить лишь ороцекальный транзит бактерий.

В настоящее время широкое распространение получил способ определения видов микроорганизмов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР разработал еще в 1983 году Кэри Мюллис, за что в 1993 г. он был удостоен Нобелевской премии в области химии. В основу метода ПЦР положено многократное копирование (амплификация) искомого фрагмента ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. По сравнению с традиционными методами диагностики ПЦР отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Он позволяет использовать для диагностики образцы с менее жесткими требованиями к жизнеспособности исследуемых микроорганизмов, чем для исследования микробиологическими методами. Сегодня существует более совершенный, чем "классический", метод ПЦР - с детекцией результатов в режиме реального времени. Этот метод основан на автоматическом измерении уровня флуоресцентного сигнала, увеличивающегося с каждым циклом при положительной реакции ПЦР, что позволяет проводить количественную оценку ДНК исследуемого микроорганизма в биологическом образце.

Эволюция человека и животных проходила при постоянном контакте с миром микробов, в результате чего сформировались тесные взаимоотношения между макро- и микроорганизмами. Влияние микрофлоры ЖКТ на поддержание здоровья человека, его биохимического, метаболического и иммунного равновесия несомненно и доказано большим количеством экспериментальных работ и клинических наблюдений. Ее роль в генезе многих заболеваний продолжают активно изучать (атеросклероз, ожирение, синдром раздраженного кишечника, неспецифические воспалительные заболевания кишечника, целиакия, колоректальный рак и др.). Поэтому проблема коррекции нарушений микрофлоры, по сути, является проблемой сохранения здоровья человека, формирования здорового образа жизни.

Необходимо помнить, что дисбиотические нарушения всегда вторичны. Поэтому устранение причин, лечение основного заболевания, на фоне которого развиваются нарушения микробиоценоза кишечника, является одним из ведущих принципов его коррекции. Наряду с воздействием на основное заболевание и повышением резистентности организма при коррекции дисбиотических нарушений показано: нормализация моторной функции кишечника, применение энтеросорбентов, назначение антибактериальных препаратов, пре- и пробиотиков, синбиотиков.

Указанными свойствами обладает используемый в современной клинической практике Бактистатин® - комплексный препарат природного происхождения, инновационный энтеросорбент с пробиотическим действием.

Препарат Бактистатин® состоит из трех компонентов, взаимно усиливающих действие друг друга. Основой препарата является стерилизованная культуральная жидкость природного микроба Bacillus Subtilis с высокими медико-биологическими свойствами, содержащая пробиотические вещества (лизоцим, бактериоцины, каталазы), ферменты и аминокислоты. Бактерицидное и бактериостатическое влияние на патогенные и условно патогенные микробы обусловлено содержанием пробиотических веществ, синтезируемых в процессе вегетативного роста бактерий B. Subtilis штамма и концентрированием их в культуральной жидкости за время ферментации. Таким образом, пробиотические соединения в составе Бактистатина® обеспечивают восстановление нормальной микрофлоры кишечника, повышают неспецифическую резистентность организма.

Второй компонент - цеолит, природный сорбент, обладающий ионнообменными свойствами. Цеолит способен проявлять сорбционные свойства преимущественно по отношению к соединениям с низкой молекулярной массой (метан, сероводород, аммиак и другие токсические вещества), не вступая в прямое взаимодействие с витаминами, аминокислотами, белками, оставляя их в желудочно-кишечном тракте. Ионы, содержащиеся в организме, могут включаться в кристаллическую структуру минерала, и, наоборот, из минерала организм получает те неорганические элементы, в которых испытывает потребность. Происходит так называемый селективный ионообмен. Цеолиты способствуют нормализации жирового, белкового, углеводного обмена; повышению иммунитета; повышают устойчивость к стрессу; улучшают репродуктивную функцию, функции печеночных клеток; нормализует перистальтику кишечника, ускоряя продвижение содержимого кишечника по пищеварительному тракту.

Также в состав Бактистатина® входит гидролизат соевой муки, который является естественным источником полноценного белка аминокислот, олигосахаридов, обеспечивает максимально благоприятные условия для бесконкурентного роста нормальной флоры и восстановления микробного пейзажа организма.

Бактистатин® особо эффективен для нормализации микрофлоры кишечника при острых и хронических заболеваниях ЖКТ с явлениями дисбактериоза, при дисбактериозах, возникающих при синдроме раздраженной кишки, в результате антибиотикотерапии, после перенесенных кишечных инфекций.

Литература

1. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. - Санкт-Петербург: Питер. - 2000. - С.17

2. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. - М.: Издательская группа "ГЭОТАР-Медиа". - 2007. - С.8-35

3. Григорьев А.В. Желудочно-кишечный тракт как среда обитания бактерий// Раздел 1. - М.: Издательство: ЗАО "СИЛМА". - 2004.- С.5-7, С.16-32

4. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Костадинова В.Н. и др. Пребиотики и пробиотики при нарушениях кишечного микробиоценоза у детей. - М.: ИД "Медпрактика-М". - 2004. - С.8-9

5. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз и интеллект человека. - Санкт-Петербург: СпецЛит. - 2006. - С.110-113

6. Урсова Н.И. Современные технологии в коррекции дисбактериозов у детей. - Учебное пособие. - Москва. - 2003. - С.4-6.

7. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N. et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. // Science. 2005. - 308.- Р.1635-1638.

8. Ghoshal U.C., Park H., Gwee K.-A. Bugs and Irritable Bowel Syndrome: The Good, the Bad and Ugly. // J Gastroenterology, Hepatology. - 2010. - 25 (2). - P.244-251.

9. O’Hara А.М., Shanahan F. Обзор. Кишечная микрофлора: анализ терапевтического потенциала. // Клиническая гастроэнтерология и гепатология. Русское издание. - 2008.- Том1, №4: 236-247.

10. Spiller R.С. Review Article: Probiotics and Prebiotics in Irritable Bowel Syndrome // Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2008; 28(4):385-396.