Пандемический грипп 2009 г.: происхождение, антигенные, биологические свойства вируса и чувствительность к противовирусным препаратам

Еропкин М.Ю., Гудкова Т.М., Даниленко Д.М., Коновалова Н.И., Григорьева В.А., Смирнова Т.С., Иванова А.В., Брязжикова Т.С., Еропкина Е.М., Щеканова С.М.

В последние эпидемические сезоны в человеческой популяции отмечалась, как и обычно, со-циркуляция вирусов гриппа всех трех подтипов А(H1N1), А(H3N2) и В. Однако следует обратить внимание на активизацию в предпоследние три эпидемических сезона вирусов гриппа А(H1N1). Показатели - титры сывороток в реакции торможения гемагглютинации по сравнению с гомологичными титрами эталонных штаммов гриппа. В России в этом эпидемическом сезоне были выявлены три антигенно различные группы штаммов, существенно отличающихся друг от друга. Для вирусов гриппа А(H1N1) характерна "молчащая" изменчивость, которая проявляется постепенным накоплением аминокислотных замен у минорной, нерегистрируемой группы вирусов. Такая изменчивость часто носит дивергентный характер [1,2]. Подтверждением этой гипотезы служит появление и распространение в 2008-2009 гг. нескольких обособленных в антигенном отношении кластеров вируса гриппа А(H1N1). Резкая активизация антигенного дрейфа вирусов подтипа А(H1N1) в последние эпидемические сезоны могла служить предвестником появления пандемического штамма данного подтипа.

В 2009 г. человечество столкнулось с началом и развитием первой в XXI столетии пандемии, вызванной принципиально новым вариантом вируса гриппа А(H1N1)v - тройным реассортантом, сочетающим сегменты РНК, происходящие от штаммов гриппа человека, свиней и птиц [3-5 ].

Это новый вирус гриппа, возникший в 2009 году и обладающий уникальной комбинацией генома, содержит сегменты РНК, происходящие от Североамери­канской линии свиного гриппа (сегменты HA, NP и NS), Евразийской линии свиного гриппа (сегменты NA и М), Североамериканской линии птичьего происхождения (сегменты РА и РВ2) и сегмент РВ1 от сезонного гриппа подтипа H3N2. У человека отсутствует иммунитет к этому вирусу. Вирус A(H1N1)v2009 высококонтагиозен, за 6 недель он распространился по всему земному шару. У других штаммов вируса гриппа этот срок составляет обычно около 6 месяцев. В настоящее время этот вирус доминирует в популяции человека и вытесняет сезонные штаммы. Название этого вируса еще не устоялось, ряд исследователей предлагают полностью отказаться от упоминания "свиной грипп" в названии, заменив его на А(H1N1)v, где v - "вариант", или просто на "пандемический грипп A(H1N1) 2009";. Грипп, вызванный вирусом A(H1N1)v, имеет симптомы обычного сезонного гриппа. Выздоровление часто происходит за 7 дней. Смертность повышена у людей с хроническими заболеваниями и осложнениями.

Временной график развития пандемии 2009 г. выглядит следующим образом:

• 12 апреля ВОЗ получила уведомление о вспышке гриппоподобного заболевания в Мексике (Веракруз);
• 15-17 апреля: два случая инфекции, вызванные новым вирусом А(H1N1) в штате Калифорния, США;
• 23 апреля в Мексике подтверждены несколько случаев;
• 24 апреля ВОЗ объявляет о чрезвычайной ситуации в области общественного здоровья;
• 27 апреля ВОЗ объявляет 4 фазу предупреждения о пандемии - стойкая передача от человека к человеку;
• 29 апреля ВОЗ объявляет 5 фазу предупреждения о пандемии - инфекция зарегистрирована в 2 странах одного региона ВОЗ;
• 11 июня ВОЗ объявляет 6 фазу предупреждения о пандемии - инфекция зарегистрирована во втором регионе ВОЗ;
• В течение последующих 9 недель во всех регионах ВОЗ зарегистрированы случаи, вызванные пандемическим штаммом А (H1N1).

На декабрь 2009 г. пандемией оказались охвачены 208 стран. Точное число заболевших установить невозможно, так как по рекомендации ВОЗ уже с июля 2009 г. прекращен сквозной скрининг мазков на вирусы гриппа, поскольку это превышало пропускную способность лабораторий даже самых развитых стран, где уровень заболеваемости был высоким. По данным на 18 декабря 2009 года, в мире зарегистрировано не менее 10582 лабораторно подтвержденных случаев заболевания с летальным исходом. На самом деле реальный уровень смертности существенно выше, так как в большом числе случаев у погибших просто не брались пробы или вообще не ставился диагноз "грипп" как причина смерти [5].

ВОЗ изучила генетику более 4000 штаммов вируса гриппа A(H1N1)v 2009.

Было выявлено, что степень гомологии пандемического гриппа со штаммом А/Брисбен/59/07 (H1N1), рекомендованным в качестве вакцинного на сезон 2009-2010 гг., составляет:

• по последовательности НА 79% (отличия по103 аминокислотам);
• по последовательности NA 77,3% (отличия по 87 аминокислотам);
• данный штамм ранее не циркулировал в человеческой популяции: кросс-реактивные антитела к нему практически отсутствуют у лиц моложе 18 лет, обнаружены в 6-9% у лиц 18-64 года и у 33% - старше 60 лет, поэтому население характеризуется высокой восприимчивостью к данному вирусу.

В настоящее время отмечается высокий уровень передачи инфекции по всему миру. В Северной Америке и ряде стран Европы (Великобритания, Испания) прошла пик уже вторая волна пандемии (первый подъем заболеваемости наблюдался в мае-июле). В России, по данным НИИ гриппа, в декабре 2009 г. также наблюдался спад заболеваемости, что свидетельствует о прохождении пика первой волны пандемии [6].

Чтобы свести к минимуму последствия пандемии, ВОЗ рекомендует иммунопрофилактику гриппа, однако в период пандемии вводится ограничение на применение живых вакцин из-за возможности реассортации. Для групп риска рекомендуется сочетание вакцинации с химиотерапевтическими препаратами в профилактических дозах. Это прежде всего люди с повышенной заболеваемостью, врачи и сотрудники научно-исследовательских институтов, работающие с вирусом гриппа.

Календарь иммунизации населения Российской Федерации против гриппа в сезон 2009-2010 гг. включал иммунизацию сезонной тривалентной вакциной состава: А/Брисбен/10/07 (H3N2); А/Брисбен/59/07 (H1N1) и В/Брисбен/60/08 в августе-октябре и иммунизацию пандемической моновакциной штаммового состава А/Техас/05/09 или А/Калифорния/07/09 (H1N1)v в ноябре-декабре. Вероятно, в следующем эпидемическом сезоне штамм пандемического А(H1N1)v будет включен в состав тривалентной вакцины вместо сезонного А(H1N1), поскольку рекомендованный ВОЗ состав гриппозной вакцины для Южного полушария на 2010 г. выглядит следующим образом:

• А/Калифорния/07/09 (H1N1)v,
• А/Перт/16/09 (H3N2),
• В/Брисбен/60/08.

Для лечения больных вирусом гриппа A(H1N1)v ВОЗ рекомендует:

• обязательную противовирусную терапию;
• применение антибиотиков только в случае пневмонии;
• постоянное насыщение кислородом, для исключения развития пневмонии.

Не рекомендуется:

• использование кортикостероидов, т.к. у молодых людей при выздоровлении наблюдаются аутоиммунные реакции;
• применение таких жаропонижающих, как ацетилсалициловая кислота и парацетамол.

Для больных с подозрением на грипп A(H1N1)v требуется госпитализация в случае появления у них одышки даже при малейшей физической нагрузке, синюшности в состоянии покоя, кровавого цвета в мокроте, изменения психики, у детей трудности с пробуждением [7].

В качестве основного метода специфической диагностики пандемического гриппа ВОЗ и Роспотребнадзором РФ рекомендован метод ПЦР в реальном времени.

К моменту написания данной статьи в НИИ гриппа СЗО РАМН методом ПЦР в режиме реального времени диагностировано 418 случаев, положительных по A(H1N1)v (287 - из носоглоточных мазков и 131 - из постмортальных материалов), выделено 247 штаммов пандемического гриппа, однако общее число случаев, безусловно, гораздо выше, так как специфической диагностике подвергаются в основном госпитальные больные и тяжелые случаи гриппа. В этой таблице показаны репрезентативные штаммы, выделенные в С.-Петербурге и ряде городов Европейской части России. Все выделенные штаммы были гомогенны в антигенном отношении - все они реагировали с диагностической антисывороткой к пандемическому гриппу A(H1N1)v, полученной из референс-центра по гриппу ВОЗ (CDC, Атланта, США), а также с антисывороткой к эталонному штамму А/Калифорния/07/09 (H1N1)v с титрами, практически равными гомологичным титрам этих антисывороток. В то же время выделенные штаммы не вступали в реакцию ни с одной из антисывороток к остальным типам и подтипам актуальных вирусов гриппа. Первые 5 изолятов, выделенных в НИИ гриппа в июле-сентябре 2009 г., были также проанализированы в референс-центре ВОЗ по гриппу в Национальном центре медицинских исследований (NIMR) в Лондоне. Из данной таблицы видно, что выделенные штаммы (с - клеточные, выделены на культуре клеток MDCK, е - эмбриональные, выделенные из тех же патоматериалов на куриных эмбрионах), реагировали с титрами, равными или близкими к гомологичным, с антисыворотками к различным изолятам пандемического гриппа. Кроме того, интересно, что наши штаммы также хорошо реагировали с антисывороткой к штамму "свиного гриппа" 1976 г. А/New Jersey/8/76 (H1N1) с титрами ½1/2-1/8 гомологичного титра. Таким образом, по крайней мере, гемагглютинин вирусов "свиного гриппа" с тех пор не претерпел серьезных изменений.

Обратимся к вопросу о вирулентности (патогенности) пандемического гриппа. По результатам исследования высоко патогенных вирусов "птичьего гриппа" A(H5N1), которые вызывают гибель более 50% зараженных людей, в вирусном геноме выявлено 5 характерных последовательностей, определяющих высокую вирулентность вирусов. Как видно из рисунка, у вирусов пандемического гриппа не обнаружено ни одной из характерных детерминант высокой патогенности (причем в 4 сайтах из 5 пока не обнаружено даже мутаций), они генетически стабильны у всех исследованных штаммов. По всей вероятности, повышенная по сравнению с сезонным гриппом частота летальных случаев и тяжелого течения заболевания связана, главным образом, с "антигенной новизной" пандемического гриппа для большей части человеческой популяции. Однако не исключено, что в ходе второй и, возможно, третьей волн пандемии вирулентность пандемического гриппа усилится, как это имело место при пандемии "испанки" 1918-1920 гг.

По данным лабораторных исследований пандемический штамм А(Н1N1)v устойчив к адамантанам (ремантадин и амантадин), но чувствителен к ингибиторам нейраминидазы (озельтамивир и занамивир). Однако уже появилось сообщение о выделении первого вируса этой разновидности, устойчивого к озельтамивиру [5]. Опыт последних лет показывает, что практически невозможно подобрать этиотропный противовирусный препарат, эффективный против всего многообразия циркулирующих сезонных вирусов. Так, ремантадин, кроме того, что он неэффективен против гриппа В, в последние эпидсезоны не действовал на значительную часть вирусов подтипа А(Н3N2). Вирусы подтипа А(Н1N1), напротив, были в большинстве чувствительны к ремантадину, но быстрыми темпами приобретали устойчивость к озельтамивиру [1]. Все это является основанием для поиска препаратов, направленных не на вирус как таковой или его взаимодействие с клеткой, а стимулирующих клеточную резистентность, выработку интерферонов, иммунную защиту. При запаздывании на данный момент своевременного охвата достаточного контингента человеческой популяции иммунизацией вакциной против пандемического гриппа, роль таких препаратов в начальной фазе пандемии является особенно важной. Вследствие этого остается актуальным использование неспецифических препаратов против ОРВИ, включая растительные и гомеопатические препараты.

Одним из таких препаратов является Инфлюцид ("Дойче Хомеопати-Унион"), имеющий следующий состав: 100 г раствора содержит - Aconitum D3 10g, Gelsemium D3 10g, Ipecacuanha D3 10g, Phophorus D5 10g, pyonia D2 10g, Eupatonum perfoliatum D1 10g. Прочие ингредиенты: Eucalyptus globules, 96% этанол, вода очищенная. Содержание алкоголя 45 об.%. Выпускается как представленная выше жидкая, так и таблетированная форма препарата. По данным литературы, Инфлюцид существенно снижает такие симптомы, присущие всем ОРЗ, как гипертермия, боли в конечностях, кашель, гиперемия слизистых, воспалительные процессы в глотке и гортани [8].

Нами исследовано противовирусное действие препарата Инфлюцид in vitro (в культуре клеток MDCK) в отношении эталонных современных штаммов гриппа человека А(H3N2), А(H1N1) и В, высокопатогенного штамма гриппа А птиц (H5N1) и низкопатогенного штамма гриппа птиц А(H5N2), а также эталонного штамма пандемического гриппа А(H1N1)v - А/Калифорния/07/09 и репрезентативного российского штамма пандемического гриппа, выделенного в сентябре 2009 г. в НИИ гриппа А/С.-Петербург/05/09 (H1N1)v. Результаты представлены на рисунке 4. Все тестированные штаммы были в той или иной степени чувствительны к действию Инфлюцида, что проявлялось в снижении титра вируса по сравнению с контролем (lgТИД50) при оценке продукции вирусных частиц в реакции гемагглютинации (РГА). При введении образцов Инфлюцида по лечебной схеме (через 1 час после заражения клеток) препарат умеренно подавлял продукцию вирусных частиц, выявляемую в реакции гемагглютинации) - при концентрации 1% снижение гемагглютинирующей активности ( ΔlgТИД50) вируса А/Калифорния/07/09 составило 1,2, а при дозе 0,5% - 0,5, т.е. инфекционная активность вируса упала более чем в 10 и 6,3 раза соответственно. Аналогичные результаты получены в отношении репрезентативного российского изолята пандемического гриппа А/СПб/05/09 (H1N1)v - падение инфекционной активности в 6,7 раза.

Вторым важным индикатором защитного действия препарата служила реакция восстановления клетками в культуре тетразолиевого красителя МТТ (Тиазолила голубого), интенсивность которой отражает степень жизнеспособности клеток в результате восстановления красителя митохондриальными и частично цитоплазматическими дегидрогеназами. Тест часто используется в вирусологии для оценки цитопатогенного действия вирусов на клетку [9]. Его результаты можно интерпретировать, как степень устойчивости клеток к действию вирусов. Микротетразолиевый тест также широко используется в оценке воздействия на клетки токсикантов, фармакологических препаратов, неблагоприятных факторов окружающей среды [10], поэтому одновременно с противовирусным эффектом можно оценивать токсичность исследуемых препаратов in vitro. Препарат вводили в среду культивирования клеток за 1-24 час до заражения вирусом ("профилактическая" схема введения) и через 1 час после заражения вирусом ("лечебная" схема введения) в разведении на буфере PBS 0,125-1,0% (концентрация в среде исходного жидкого препарата).

При оценке в тесте восстановления МТТ выявлено существенное уменьшение цитопатогенного действия вируса как при "профилактической", так и при "лечебной" схемах введения препарата. При "профилактической" схеме действие препарата было дозозависимым - Инфлюцид в концентрации 1% имел достоверно более сильное воздействие, чем 0,5%-й.

Препарат существенно снижал цитопатогенное действие in vitro не только вирусов гриппа, но и вирусов герпеса I II типов и аденовируса III типа при оценке цитопатической реакции методом МТТ и "профилактической" схеме введения препарата. Обращает на себя внимание, что более низкие дозы препарата (0,125-0,25%) были эффективнее в отношении вирусов простого герпеса и аденовируса, чем относительно более высокая доза - 0,5%. Таким образом, Инфлюцид обладает широким спектром защитного действия на клеточном уровне в отношении целого ряда вирусов в отличие от многих узконаправленных этиотропных препаратов.

Выводы:

• В большинстве регионов России к концу декабря 2009 г. прошла первая волна пандемии гриппа, вызванной вирусом А(H1N1)v.
• Заболеваемость гриппом в России в сентябре-декабре 2009 г. носила практически моноэтиологический характер: при анализе более 1000 мазков и секционных патоматериалов нами не выделено за этот период других вирусов гриппа, кроме пандемического А(H1N1)v.
• По данным антигенного и молекулярно-генетического анализа вирус пандемического гриппа не претерпел в ходе первой волны сколько-нибудь существенного изменения (антигенного дрейфа).
• Препарат Инфлюцид обладает широким спектром защитного действия на клеточном уровне в отношении ряда вирусов (различных разновидностей гриппа, герпеса, аденовируса), в том числе и штамма пандемического гриппа, выделенного в России.

Литература
1. Еропкин М.Ю., Грудинин М.П., Коновалова Н.И. и др. Антигенные и генетические особенности современных вирусов гриппа в России// Материалы I Всероссийского Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням. М., 30 марта-01 апреля, 2009. - С. 67.
2. Киселев О.И., Маринич И.Г., Соминина А.А. (ред.). Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия. - СПб. 2003. - 244 С.
3. Dawood F.S., Jain S., Finelli L. et al. Emergence of a novel swine-origin influenza A (H1N1) virus in humans // New Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 361 - P. 1-10.
4. Zimmer S.M., Burke D.S. Historical perspective - emergence of influenza A(H1N1) viruses // N.Engl.J.Med. - 2009. - Vol. 361 - P. 279-285.
5. http://www.who.int/csr/disease/swineflu/en/index.html
6. http://www.influenza.spb.ru
7. Селькова Е.П. Современные технологии профилактики и лечения гриппа // Симпозиум по проблеме высокопатогенного гриппа А/Н1N1 и ОРВИ. 14.10.2009, СПб.
8. Гаращенко Т.И., Гаращенко М.В., Мезенцева М.В. Клинико-иммунологическое обоснование гомеопатических препаратов в профилактике и лечении гриппа и ОРВИ //Русский медицинский журнал.-2005.-Т.13.-№13.-С.1432-1437.
9. Watanabe W., Konno K., Ijichi K., et al. MTT colorimetric assay system for the screening of anti-orthomyxo- and anti-paramyxoviral agents // J. Virol. Methods. - 1994. - Vol. 48 - No.2-3 - P. 257-265.
10. Borenfreund Е, Babich H, Martin-Alguacil N. Comparison of two in vitro cytotoxicity assays - the neutral red (NR) and tetrazolium (MTT) tests // Toxicol. In Vitro. - 1988. - Vol. 2 - No. 1. - P. 1-6.