Hsp90 как аутоантиген при дилатационной кардиомиопатии.

Согласно определению специальной исследовательской группы ВОЗ и Международного общества и Федерации кардиологов дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) – заболевание миокарда, связанное с нарушением функции сердца и характеризующееся дилатацией и снижением сократимости левого или обоих желудочков. Выделяют семейную (наследственную) и спорадическую (ненаследственную) формы заболевания [8]. Среди этиологических теорий спорадической ДКМП до настоящего времени доминирует вирусная теория, согласно которой в большинстве случаев развитию заболевания предшествует миокардит. Однако в последние годы все больше внимания уделяют изучению молекулярно-генетических механизмов гибели кардиомиоцитов (КМЦ) и формированию миокардиального повреждения. Доказана важная патогенетическая роль аутоиммунных процессов и выявлен целый ряд аутоантигенов при ДКМП [5, 6]. Идентифицировано около 100 белков миокарда со значительными альтерациями в экспрессии при ДКМП: цитоскелетные и миофибриллярные белки, протеины, ассоциированные с продукцией энергии митохондриями и т. д. В последнее время большой интерес вызывают белки стресса или молекулярные шапероны (HSPs), представляющие семейство высококонсервативных специализированных молекул, которые участвуют во многих внутриклеточных процессах [3, 4]. Они отвечают за корректный белковый холдинг, транспорт предшественников органелльных белков в соответствующие клеточные компартменты, формирование стресс-индуцированных регуляторных сигнальных каскадов и вовлечены в протеасомную деградацию убиквитинированных белков.

Большое значение для функционирования КМЦ как в физиологических условиях, так и в условиях стресса, имеет молекулярный шаперон Hsp90. Данный шаперон – основной функциональный компонент важных цитоплазматических комплексов, вовлеченных в пролиферацию, дифференциацию, сигнальную трансдукцию, белковый фолдинг и деградацию. Отличительной особенностью Hsp90 является то, что большинство его субстратов/мишеней принадлежит к белкам сигнальных путей [16].

Важным представляется тот факт, что HSPs часто ассоциируется с протеолитической системой. Стрессовый сигнал ведет к транскрипционной активации генов, кодирующих не только компоненты шапероновой активности, но и системы протеолиза [10, 15]. Недавно также была показана ключевая роль Hsp90 в общем пути деградации микросомального цитохрома Р450 2Е1 in vitro, но механизмы этого взаимодействия не известны [8].

Цель исследования – идентифицировать и изучить особенности циркулирующих анти-Hsp90 аутоантител у пациентов с кардиомегалией, развившейся в результате дилатационной кардиомиопатии или ишемической болезни сердца, а также определить возможные изменения экспрессии Hsp90 на уровне белка в миокарде при ДКМП.

Материал и методы

Уровень антител исследовали помощью метода ЕLISA в сыворотке крови больных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) IIА–IIБ стадии, II–III функционального класса по NYHA. У 40 больных ХСН и кардиомегалия были обусловлены ДКМП (группа ДКМП), у 40 пациентов – ишемической болезнью сердца (группа ХСН – сравнения). В качестве контроля обследовали сыворотку крови 28 здоровых доноров.

Hsp90 получали из мозга быка согласно методике W. Sulliwant и соавторов (1997) с некоторыми модификациями. Поликлональные антитела к Hsp90 получали в результате иммунизации кроликов по схеме, разработанной нами ранее [1]. Высаливание иммуноглобулинов из антисыворотки проводили при 50 % насыщении сыворотки сульфатом аммония. Переосаждение иммуноглобулинов повторяли 2–3 раза и сохраняли с добавлением 0,3 % азида натрия при +4 °С.

Очистку антител проводили с помощью ДЕАЕ-целлюлозы и протеин-G сефарозы. Моноспецифические антитела получали методом аффинной хроматографии IgG фракции антител на колонке CNBr-активированной сефарозы с пришитым антигеном по методу L. Sidorik и соавторов (1991). Аффинность полученных анти-Hsp90 антител проверяли в реакции ELISA (P. Matsiota и соавт., 1987), специфичность – методом Western-blot анализа (T. Ternynck и соавт., 1990).

Уровень экспрессии Нsp90 в лизатах миокарда определяли с помощью метода иммуно-блоттинга (Western-blot-analysis), используя протокол фирмы "Pierce" для ECL-системы.

Суммарный лизат КМЦ получали по разработанной нами раньше схеме (L. Sidorik и соавт., 1991). Чистоту белков контролировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 12 % ПААГ по методу Лэммли (U.K. Laemmli, 1970). Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (M. Bradford, 1976).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ Statistica for Windows 5.1. Для оценки достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента и U-тест Манна–Уитни. Значение Р<0,05 рассматривали как критерий достоверности.

Результаты и их обсуждение

Исходя из известных критериев Витебского первым шагом для идентификации аутоантигена является изучение его иммуногенности, то есть определение уровня циркулирующих специфических аутоантител (N.R. Rose, C. Bona, 1993). На рис. 1 представлены результаты исследования уровня антител к Hsp90 в сыворотках пациентов исследуемых групп. Выявлено, что уровень данных специфических антител в сыворотке больных с ДКМП и пациентов с ХСН группы сравнения был значительно и достоверно выше, чем у здоровых. При этом подавляющее большинство сывороток в обеих группах больных (95 % в группе ДКМП и 100 % в группе сравнения) были антитело-позитивными. Более высокий уровень данных антител выявлен у больных с ДКМП. Титры аутоантител к Hsp90 у больных с ДКМП почти в восемь раз превышали аналогичные значения у здоровых.

Известно, что аутоантитела, как натуральные антитела, узнают ограниченный пул собственных антигенов, которые высококонсервативны в эволюции и консервативность которых сохраняется в течение всей жизни индивидуума (B.D. Stollar, 1991). Белки теплового шока (Hsp) являются высококонсервативными аутоантигенами.

Ранее нами был обнаружен повышенный уровень циркулирующих анти-Hsp60 аутоантител (67 % сывороток), изменение экспрессии данного белка в миокарде и перераспределение его уровня в клеточных компартментах при ДКМП [11]. Однако, известно, что Hsp60 представляет группу "индуцибельных" белков и вырабатывается главным образом под воздействием стресса. Напротив, Hsp90 высококонсервативен и конститутивно экспрессируется во многих тканях, включая миокард (R.S. Gupta, 1995). Его экспрессия может регулироваться различными стимулами и митогенными сигналами.

Функциональное значение Hsp90 очень велико. Hsp90 отличается от других шаперонов тем, что большинство его субстратов принадлежит к белкам сигнальных путей. Данный молекулярный шаперон специфически связывает стероидные рецепторы, протеинкиназы, промежуточные филаменты, микротрубочки, актиновые филаменты и является активирующим компонентом глюкокортикоидного рецептора, который формирует комплекс с некоторыми другими белками. Полная функциональная активность Hsp90 проявляется в кооперации с другими ко-шаперонами. Hsp90 играет важную роль в фолдинге de novo синтезированых белков, стабилизации и рефолдинге денатурированых белков после стресса [16].

Оказалось, что молекулярный шаперон Hsp90 вовлечен также в регуляцию сигнальных путей деградацией белков протеасомным комплексом. Недавно была показана ключевая роль Hsp90 в общем пути деградации микросомального цитохрома Р450 2Е1 in vitro, однако до сих пор остаются неизвестными механизмы этого взаимодействия [8].

Недавно было показано, что шапероны в комплексе с пептидами могут действовать как молекулярный адъювант, помогая презентировать и репрезентировать эндо- и экзогенные антигены в антиген-презентирующих клетках. Кроме того, Hsp90 имеет высокую гомологию со многими белками цитоскелета, включая миозин, актин, тубулин, титин. Гомология обусловлена тем, что и в данных белках, и в Hsp90 присутствуют схожие домены, состоящие в основном из лизиновых и/или глутаминовых остатков, включающих сиквенсы KKIK, GLELPE и высококонсервативный эпитоп KILKVIRK (A. Dughaym, R.C. Mattews, J.P. Burnie, 1994). Это объясняет тот факт, что Hsp90 является иммунодоминантным антигеном, узнаваемым натуральными полиреактивными антителами и вследствие молекулярной мимикрии может быть катализатором аутоиммунных патологических реакций [13]. Это также предполагает универсальную роль Hsp90 как одного из центральных звеньев во взаимодействии натуральных аутоантител, шаперонов, ко-шаперонов и других высококонсервативных аутоантигенов с гомологичными сиквенсами, состоящими из повторов заряженных аминокислот.

Как указывалось выше, Hsp90 экспрессируется в миокарде. Особенности экспрессии Hsp90 в миокарде при ДКМП исследовали с помощью моноспецифических поликлональных анти-Hsp90 антител высокой степени чистоты и аффинности. Изменения уровня экспрессии исследуемого антигена в миокарде при ДКМП незначительны. Это согласуется с результатами исследования A.A. Knowlton и соавторов (1997), проведенного на биопсийном материале, полученном при трансплантации сердца.

Роль аутоантител при ДКМП активно изучалась в последнее десятилетие. Доказано, что аутоантитела к компонентам сердечной мышцы являются неспецифическими маркерами ее повреждения. Данные аутоантитела также могут участвовать в различных физиологических процессах, таких как удаление инфекционных агентов и стареющих клеток. С другой стороны, было продемонстрировано повреждающее действие антикардиальных антител на миокард с развитием в нем функциональных и морфологических изменений дистрофического и воспалительного характера, вплоть до некрозов (I. Friedman, A. Laufer, 1976). Введение антимиозиновых антител генетически-чувствительным мышам может индуцировать развитие у них аутоиммунного миокардита, морфологически сходного с тем, который происходит при иммунизации животных миозином (L. Liao и соавт., 1995). Кроме того, доказано, что натуральные антитела способны проникать не только через клеточные, но и через ядерные мембраны и блокировать либо активировать соответствующие антигены-мишени в клетке (A. Ruiz-Arguelles и соавт., 1997).

В связи с этим изучение возможной патофизиологической роли анти-Hsp90 аутоантител представляет значительный интерес. Идентификация и исследование их биологической активности, включая поиск возможных протабзимов [14], поможет лучше понять механизмы прогрессирования, а возможно и развития миокардиального повреждения. Для этого необходима детальная идентификация наиболее иммуногенных эпитопов на молекуле Hsp90, которые могут соответствовать участкам взаимодействия с ко-шаперонами и белками-партнерами Hsp90 [9], изменения экспрессии и функций которых приводят к альтерации сигнальной трансдукции и гомеостаза кальция в КМЦ [12], а также к индукции апоптоза [7], что проявляется при манифестации сердечной недостаточности.

Литература

1.Капустян Л.Н., Рожко О.Т., Бобик В.І. та ін. Одержання та характеристика анти-Sgt1 моноспецифічних антитіл // Биополимеры и клетка. – 2007. – Т. 23, № 6. – C. 435-439.

2.Капустян Л., Рожко О., Бобик В. та ін. Вивчення вмісту молекулярного шаперону Hsp60 в тканині серця при дилатаційній кардіоміопатії // Биополимеры и клетка. – 2008. – Т. 24, № 2. – С. 234-240.

3.Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. Протеомные исследования мышечных белков человека и некоторых других позвоночных // Биохимия. – 2004. – Т. 69, Вып. 11. – С. 1574-1591.

4.Arrel D.K., Ne I., van Eyk J.E. Cardiovascular proteomics: evolution and potential // Circ. Res. – 2001. – Vol. 88. – P. 763-773.

5.Fatkin D., Graham R. Molecular mechanisms of inherited cardiomyopathies // Physiol. Rev. – 2002. – Vol.82. – P.945-980.

6.Fu M., Matsui S. Is cardiomyopathy an autoimmune disease? // Keio J. Med. – 2002. – Vol. 4. – P. 208-212.

7.Gill C., Mestril R., Samali A. Losing heart: the role of apoptosis in heart diseases – a novel therapeutic target? // FASEB J. – 2002. – Vol. 16. – P. 135-146.

8.Goasduff T., Cederbaum A.I. CYP2E1 degradation by in vitro reconstituted systems: role of molecular chaperone Hsp90 // Arch. Biochem. Biophys. – 2000. – Vol. 379, № 2. – P. 321-330.

9.Lee Y.-T., Jacob J., Michowski W. et al. Human Sgt1 Binds HSP90 through CHORD-Sgt1 domain and not the tetratricopeptide repeat domain // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, № 14. – P. 16511-16517.

10.Maron B.J., Towbin J.A., Thiene G. et al. Contemporary Definitions and Classification of the Cardiomyopathies. An American Heart Association Scientific Statement From the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention // Circulation. – 2006. – Vol. 113. – P. 1807-1816.

11.Nollen E.A.A., Morimoto R. Chaperoning signaling pathways: Molecular chaperons as stress-sensing "heat shock" proteins // J. Cell. Sci. – 2002. – Vol. 115. – P. 2809-2816.

12.Nowotny M., Spiechowicz M., Jastrzhebska B. et al. Calcium-regulated Interaction of Sgt1 with S100A6 (Calcyclin) and Other S100 Proteins // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, № 29. – P. 26923-26928.

13.Pashov A., Kenderov A., Kyurkchiev S. et al. Autoantibodies to heat shock protein 90 in the human natural antibody repertoire // Internal. Immunol. – 2002. – Vol. 14, № 5. – P. 453-461.

14.Ponomarenko N., Durova O., Vorobiev I. et al. Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models // J. Immunol. Methods. – 2002. – Vol. 269. – P. 197-211.

15.Snoeckx L.H.E.H., Cornelussen R.N., van Nieuwenhoven F.A. et al. Heat Shock Proteins and Cardiovascular Pathophysiology // Physiol. Review. – 2001. – Vol. 81. – P. 1461-1498.

16.Sreedhar A.S., Kalmar E., Csermely P., Shen Y.-F. Hsp90 isoforms: functions, expression and clinical importance // FEBS Lett. – 2004. – Vol. 562. – P. 11-15.

Л.Н. Капустян, Д.В. Рябенко, О.Г. Вигонтина, О.Т. Рожко, В. Миховски, Я. Кузницки, И.В. Крупская, Л.Л. Сидорик.

Национальный научный центр "Институт кардиологии им. акад. Н.Д. Стражеско" АМН Украины, г. Киев.

Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, г. Киев.

Интернациональный институт молекулярной и клеточной биологии, г. Варшава.