Особенности участия сериновых протеиназ в патогенезе хронической сердечной недостаточности, обусловленной ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2-го типа.

Сердечная недостаточность (СН) остается одним из самых распространенных и прогностически неблагоприятных осложнений заболеваний сердечно-сосудистой системы. По данным Европейской ассоциации кардиологов, в общей популяции она встречается у 2–3 % населения [10]. Наиболее частыми причинами развития этой патологии являются ишемическая болезнь сердца (ИБС) и артериальная гипертензия. ИБС диагностируют у 70 % больных [10]. У пациентов с сахарным диабетом (СД) СН протекает наиболее тяжело, их смертность остается на 40–80 % выше, чем у лиц без СД [12]. Несмотря на многочисленные исследования, существующие теории не в состоянии в полной мере объяснить патогенез данного явления, что определяет необходимость изучения патофизиологии СН, поиска причастных к этому биологически активных веществ. Химотрипсиноподобные сериновые протеиназы можно отнести к таким субстанциям, так как они принимают участие в развитии и прогрессировании как СН [16], так и ИБС [15] с СД [14].

Среди химотрипсиноподобных сериновых протеиназ особый интерес представляет химаза, которая является наиболее специфическим тканевым ангиотензин II-образующим ферментом АПФ-независимого пути образования ангиотензина II (А ІІ) из ангиотензина I (А I) [9]. Кроме того, интересно участие еще одной сериновой протеиназы – тонина, который образует А II не только из А I, но и непосредственно из ангиотензиногена [8]. Изучение химазы привлекательно и в связи с тем, что эта эндопептидаза активирует провоспалительные цитокины – трансформирующий фактор роста b, фактор некроза опухолей [16], вызывает патологический апоптоз кардиомиоцитов, активирует металлопротеиназы [11, 15].

Активность сериновых протеиназ регулируется несколькими факторами: способствующими дегрануляции тучных клеток (оксидантный стресс, воспалительные процессы, гипоксия и ишемия миокарда) и подавляющими их активность внеклеточно. К последним относятся естественные ингибиторы протеолиза, такие как a2-макроглобулин (a2-МГ) и a1-ингибитор протеиназ (a1-ИП) [2, 4, 5, 13]. Альфа1-ингибитор протеиназ практически полностью (>95 %) подавляет активность сердечной фракции химазы [13], угнетая активность этой протеиназы, не связанной с гепарином [2]. Более эффективным ингибитором считается a2-МГ, так как он способен подавлять активность этой эндопептидазы в комплексе с гепарин-протеогликаном [2] и является важнейшим фактором защиты соединительной ткани от деструктивного воздействия эндогенных протеиназ [6].

Активность химазы, тонина при СН, ИБС и СД 2-го типа изучали в основном в экспериментальных работах. Выполненные исследования касались преимущественно тканевой активности этих протеиназ. Имеются немногочисленные работы, характеризующие их активность в сыворотке крови у лиц с СН [1, 4], ИБС [1], СД 2-го типа [5]. Исследования, оценивающие активность химазы, тонина и их ингибиторов у больных СН, обусловленной ИБС и СД 2-го типа, отсутствуют.

Цель работы – изучение активности сериновых протеиназ (химазы, тонина) и их ингибиторов (a1-ингибитора протеиназ, a2-макроглобулина) в сыворотке крови пациентов с хронической сердечной недостаточностью разной степени тяжести, обусловленной ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2-го типа.

Материал и методы

В исследование было включено 62 больных с хронической СН, обусловленной ИБС, из них у 30 диагностирован СД 2-го типа. Среди пациентов без СД у 15 лиц отмечена СН I–II функционального класса (ФК) по классификации NYHA; у 17 – СН III–IV ФК. Среди обследованных с СД у 14 больных диагностировали СН I–II ФК, у 16 – СН III–IV ФК. Контрольную группу составили 20 практически здоровых лиц.

В исследование не включали больных с недавними (до 10 дней) эпизодами острой СН, нестабильной стенокардией, острыми и хроническими воспалительными заболеваниями в стадии обострения. Возраст обследованных – 23–75 лет. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Активность химазы, тонина, a1-ИП и a2-МГ определяли в сыворотке крови высокочувствительным (10-9–10-10 г) ферментативным методом. Метод основан на использовании в качестве субстрата протеолитической реакции иммобилизированного на поверхности полистирола маркерного фермента (пероксидаза хрена), который предварительно был конъюгирован с субстратом белковой природы [3].

Для определения активности химазы предварительно проводили реакцию подавления ферментов, таких как трипсин, плазмин, сывороточный калликреин, а также частично тонин (имеет и трипсин-, и химотрипсинподобную активность), добавлением 1:1 по объему соевого ингибитора трипсина в концентрации 0,01 мкг/мл и инкубировали 5 мин при 37 °С. Затем проводили реакцию расщепления иммобилизованного комплекса маркерного фермента и фрагмента 3-8 А II. Результаты выражали в Е (мкмоль субстрата в мин).

Определяя активность тонина, перед протеолитической реакцией подавляли активность калликреин-подобных ферментов в исследуемых образцах добавлением 1:1 по объему апротинина (20 мкг/мл) и инкубировали 5 мин при 37 °С. В качестве субстрата использовали протаминсульфат. Результаты выражали в Е (мкмоль субстрата в мин).

Трипсинингибиторную активность a1-ИП определяли, используя в качестве субстрата альбумин сыворотки быка. Оценку уровня этого ингибитора проводили после протеолитической реакции по остаточной активности маркерного фермента, рассчитывали в г/л·ч.

Для определения уровня a2-МГ в качестве субстрата протеолитической реакции использовали протаминсульфат. После проведения реакции образования комплекса протеиназа-ингибитор протеиназ к реакционной смеси добавляли 1:1 по объему соевый ингибитор трипсина в концентрации 150 мкг/мл и инкубировали 5 мин при 37 °С для связывания свободных протеиназ. Уровень a2-МГ в исследуемых образцах рассчитывали по остаточной активности трипсина, связанного с a2-МГ, в г/л·ч.

После удаления продуктов реакции определяли остаточную активность маркерного фермента при помощи фотометра-анализатора иммуноферментного Humareader (Human, Германия).

В комплекс инструментальных методов входили: рентгентелевизионное исследование органов грудной клетки с выявлением признаков венозного застоя в легких, эхокардиография, электрокардиография. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistika 6.0 (StatSoft Inc, США).

Результаты и их обсуждение

У больных с ИБС без СД достоверное повышение активности химазы было выявлено лишь при СН III–IV ФК. В сыворотке крови пациентов с СН I–II ФК значение этой эндопептидазы было выше, чем в группе контроля, однако не достоверно. Также отсутствовали существенные отличия активности протеиназы между группами больных с СН I–II и III–IV ФК.

У пациентов с сопутствующим СД 2-го типа показатели химазы были наиболее высокими. Ее активность у этих больных существенно увеличилась уже при СН I–II ФК по сравнению как с группой контроля (P<0,05), так и с пациентами с СН I–II ФК без СД (P<0,05). При нарастании тяжести СН регистрировали дальнейшее увеличение ферментативной активности (см. табл. 1), которая превышала показатели не только у больных с СН I–II ФК при СД 2-го типа, но и показатели пациентов с СН III–IV ФК без СД (P<0,05).

Уровень тонина у пациентов с ИБС без СД повышался существенно (P<0,05) только при СН I–II ФК. Нарастание тяжести СН сопровождалось некоторым снижением активности этой протеиназы, которая у больных с СН III–IV ФК не отличалась от группы контроля. У лиц с СД 2-го типа выявлены аналогичные изменения содержания тонина: достоверное повышение при СН I–II ФК (см. табл. 1).

Таким образом, значительное повышение активности химазы у больных с ИБС без СД выявлено только при выраженной СН, а у больных с СД 2-го типа эта протеиназа повышается даже при начальных проявлениях СН и нарастает при прогрессировании заболевания, тогда как активность тонина значительно повышалась лишь при начальных проявлених заболевания, независимо от наличия СД.

При анализе изменений ингибиторов сериновых протеиназ было выявлено, что активность a2-МГ у всех пациентов была значительно снижена по сравнению с группой контроля. У больных с ИБС без СД при СН I–II ФК этот показатель был достоверно меньше (P<0,05), чем в группе контроля. У пациентов с СН III–IV ФК и ИБС активность a2-МГ была также ниже, чем в группе контроля (P<0,05), однако достоверных различий по сравнению с таковой у больных с СН I–II ФК не наблюдали (табл. 2). У лиц с СД 2-го типа уровень этого ингибитора был самым низким (см. табл. 2). Его активность у больных с СН I–II ФК при СД была значительно меньше не только по сравнению с группой контроля (P<0,05), но и с пациентами с СН I–II ФК без СД (P<0,05). В отличие от больных без СД 2-го типа, при нарастании тяжести СН уровень ингибитора был достоверно ниже, чем у больных с СН I–II ФК и СД (см. табл. 2) и по сравнению с пациентами с СН III–IV ФК без СД.

Изменения уровня a1-ИП при СН различной степени тяжести как у больных с CД, так и без него были недостоверными (см. табл. 2).

Таким образом, повышение активности химазы сопровождается выраженным снижением содержания a2-МГ у всех больных, однако только при СД 2-го типа активность этого ингибитора достоверно уменьшается при нарастании тяжести СН.

Выявленное нами повышение активности сериновых протеиназ и снижение их ингибиторов в сыворотке крови больных с СН, ИБС и СД 2-го типа может быть связано с развитием оксидантного стресса, хронической воспалительной активацией. Эти процессы, с одной стороны, обуславливают повреждение клеточных мембран тучных клеток и выход протеолитических ферментов из их гранул в интерстициальную жидкость, кровоток [4], а с другой стороны – снижают синтез естественных ингибиторов протеолиза [6], что приводит к уменьшению выведения химазы, тонина из кровотока и повышению их активности в сыворотке крови.

Имеются данные, свидетельствующие о том, что атеросклеротический процесс сопровождается активацией химазы. Повышение этой эндопептидазы выявлено в интиме артерий больных с ИБС [15]. Также имеются сведения о позитивной корреляционной связи между повышением уровня общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности и активностью химазы [7]. В проведенном нами исследовании отсутствие связи изменений активности a2-МГ с тяжестью СН у больных с ИБС без СД, может указывать на то, что выявленные нами сдвиги обусловлены главным образом атеросклеротическими процессами.

При СД 2-го типа активность химазы была наиболее высокой. Это может быть обусловлено тем, что, помимо атеросклеротических изменений, у этих больных гипергликемия и конечные продукты избыточного гликозилирования способствуют дополнительной активации данной протеиназы [14]. Это определяет ее значимость в указанной группе, а следовательно – и недостаток a2-МГ, так как требуется больше ингибитора на подавление активности и выведение химазы из кровотока.

Снижение активности a2-МГ и отсутствие изменений a1-ИП на фоне повышения химазы в проведенном исследовании может быть связано с тем, что a2-МГ по скорости включения в реакцию ингибирования трипсиноподобных протеиназ является первым по сравнению с a1-ИП [4], и что a2-МГ подавляет активность химазы в комплексе с гепарин-протеогликаном, который защищает протеиназу от действия a1-ИП. Полученные нами данные подтверждают тот факт, что a2-МГ является более существенным ингибитором химазы, чем a1-ИП, и дают возможность предположить, что a2-МГ имеет большее значение в развитии СН при ИБС и СД 2-го типа, чем a1-ИП.

Таким образом, нарастающее снижение активности ингибитора сериновых протеиназ a2-МГ и одновременное повышение активности сериновой протеиназы химазы свидетельствуют о явлениях неконтролируемого протеолиза у больных с хронической СН, обусловленной ИБС и СД 2-го типа; однако механизмы разбалансировки системы и особенности взаимодействия ферментов тканевого образования А II (химазы, тонина) и их ингибиторов при изучаемой патологии окончательно не установлены и требуют дальнейшего исследования.

Выводы

Для больных с сердечной недостаточностью, обусловленной ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2-го типа, характерно нарушение соотношения в системе протеиназа – ингибитор протеиназ, которое наиболее выражено при сахарном диабете 2-го типа.

Сердечная недостаточность характеризуется повышением активности сериновых протеиназ, при этом начальные проявления заболевания сопровождаются преимущественным повышением активности тонина, а развернутая картина – увеличением активности химазы.

При сердечной недостаточности отмечается снижение активности естественного ингибитора сериновых протеиназ a2-макроглобулина, изменений a1-ингибитора протеиназ не выявлено, при этом только у больных с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2-го типа уменьшение уровня a2-макроглобулина ассоциируется с прогрессированием сердечной недостаточности.

Литература

1.Арабидзе Г.Г., Белова Л.А., Чихладзе Н.М. и др. Активность химотрипсиноподобных протеиназ у больных ишемической болезнью сердца, артериальной гипертонией, неспецифическим аорто-артериитом // Тер. архив. – 2000. – № 11. – С. 36-39.

2.Гольдрин Е.Н. Активність ферменту АПФ-незалежного шляху утворення ангіотензина II – хімази в динаміці лікування хворих на гіпертонічну хворобу: Автореф. дис. … к-та мед. наук. – Х.: ПП Маркін І.В., 2002. – 20 с.

3.Самохина Л.М., Дубинин А.А. Способ определения активности протеиназ или их ингибиторов в биологических жидкостях. – Патент России № 1655991.

4.Самохіна Л.М., Лазарева С.О., Волков В.І. Особливості участі тоніну і кальпаїнів у патогенезі серцевої недостатності // Досягнення біології та медицини. – 2007. – № 1 (9). – С. 14-17.

5.Самохіна Л.М., Топчій І.І., Несен А.О. Система протеїназа-інгібітор протеїназ в оцінці вазоконстрикторних і апоптогенних змін у хворих на хронічну хворобу нирок // Укр. журн. нефрології та діалізу. – 2008. – № 1 (17). – С. 33-37.

6.Шрамко С.В., Зорина В.Н., Баженова Л.Г. и др. Особенности острофазового ответа при различных вариантах воспалительных процессов придатков матки // Бюллетень сибирской медицины. – 2007. – № 1. – С. 105-110.

7.Arakawa K., Urata H. Hypothesis regarding the pathophysiological role of alternative pathways of angiotensin II formation in atherosclerosis // Hypertension. – 2000. – № 36. – Р. 638.

8.Borges J.C., Silva J.A., Gomes M.A. et al. Tonin in rat heart with experimental hypertrophy // Amer. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003. – № 284 (6). – P. 2263-2268.

9.Cristovam P.C., Arnoni C.P., Andrade M.C. et al. ACE-Dependent and chymase-dependent angiotensin II generation in normal and glucose-stimulated human mesangial cells // Experim. Biol. Med. – 2008. – № 233. – P. 1035-1043

10.Dickstein K., Cohen-Solal A., Filippatas G. et al. ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2008 // Eur. Heart J. – 2008. – № 29. – Р. 2388-2442.

11.Heikkila H.M., Latti S., Leskinen M.J. et al. Activated mast cells induce endothelial cell apoptosis by a combined action of chymase and tumor necrosis factor-a // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2008. – № 28. – Р. 309-314.

12.Kamalesh M. Diabetes and prognosis: are systolic and diastolic heart failure different? // Heart. – 2009. – № 95. – P. 178-179.

13.Kokkonen J.O., Saarinen J., Kovanen P.T. Regulation of local angiotensin II formation in the human heart in the presence of interstitial fluid: inhibition of chymase by protease inhibitors of interstitial fluid and of angiotensin-converting enzyme by Ang-(1-9) formed by heart carboxypeptidase a-like activity // Circula-tion. – 1997. – № 95. – Р. 1455-1463.

14.Lavrentyev E.N., Estes A.M., Malik K.U. Mechanism of high glucose-induced angiotensin II production in rat vascular smooth muscle cells // Circ. Res. – 2007. – № 101 (5). – Р. 455-464.

15.Leskinen M.J., Lindstedt K.A. Wang Y. et al. Mast cell chymase induces smooth muscle cell apoptosis by a mechanism involving fibronectin degradation and disruption of focal adhesions // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2003. – № 23. – Р. 238.

16.Palaniyandi S.S., Nagai Y., Watanabe K. et al. Chymase inhibition reduces the progression to heart failure after autoimmune myocarditis in rats // Exp. Biol. Med. – 2007. – № 232 (9). – Р. 1213-1221.

Э.Н. Сердобинская-Канивец, В.И. Волков, С.А. Серик, Л.М. Самохина.

ГУ "Институт терапии им. Л.Т. Малой" АМН Украины, г. Харьков.