Патоморфологія міозиніндукованого пошкодження міокарда: експериментальне дослідження.

Одними з найбільш відомих захворювань, у патогенезі яких провідну роль відіграють порушення імунної системи і, зокрема, розвиток аутоімунних реакцій, є хронічний міокардит (ХМ) та дилатаційна кардіоміопатія (ДКМП) [1, 5, 8, 10]. Про це свідчить ціла низка як клінічних, так і експериментальних досліджень, в яких було показано, що для ХМ та ДКМП характерний підвищений рівень антитіл до багатьох антигенів, зокрема скоротливих та регуляторних білків кардіоміоцитів (актину, міозину, тропоміозину), b-адренорецепторних структур тощо [4–6, 9, 12, 14]. В той же час доведено, що антитіла є не тільки маркером аутоімунних реакцій, а й становлять важливий патогенетичний фактор уражень міокарда [9, 11, 13]. Крім того, незважаючи на численні дослідження, морфогенез хронічних імунозапальних уражень міокарда остаточно не з'ясований. Велике значення для з'ясування механізмів розвитку та прогресування міокардіальної дисфункції саме за таких умов мають експериментальні дослідження. Створення та вдосконалення експериментальних моделей з комплексним застосуванням імунологічних, молекулярно-біологічних і морфологічних методів дослідження дозволяє дослідити невизначені аспекти патогенезу різних захворювань серцево-судинної системи.

Метою дослідження було вивчення морфологічних ознак перебігу імунозапального процесу у серцевому м'язі, індукованого введенням експериментальним тваринам специфічного білкового антигену.

Матеріал і методи

Дослідження проведено на 45 мишах-самцях лінії ВАLВ/с віком 12–16 тиж, імунізованих МШД – міозином, який було виділено з вентрикулярних кардіоміоцитів осіб, померлих від ДКМП через прогресуючу серцеву недостатність, у повному ад'юванті Фрейнда (ПАФ). Мишам вводили підшкірно 100 мкл антигену (1 мг/мл), змішаного зі 100 мкл ПАФ. Через 7 днів повторно вводили 100 мкл антигену зі 100 мкл ПАФ. В контрольну групу ввійшли миші такого ж віку, яким за аналогічною схемою вводили тільки ПАФ. Серця для морфологічних досліджень отримували через 1, 2, 4, 5, 6, 7 і 8 міс від початку експерименту після декапітації тварин під легким ефірним наркозом. Для морфологічного дослідження серця тварин фіксували за допомогою 10-процентного розчину нейтрального формаліну та занурювали у парафінові блоки. Гістотопограми серця фарбували гематоксиліном і еозином, пірофуксином за методом Ван Гізон, гематоксиліном-основним, фуксином-пікриновою кислотою за методом J.T. Lie і співавторів (1971) та залізним гематоксиліном за методом Рего за загальноприйнятими прописами, а також досліджували у поляризованому світлі на мікроскопі "МРІ-5" (Польща).

Результати та їх обговорення

Дослідження міокарда у мишей контрольної групи показали, що введення лише ПАФ не призводить до його морфологічних змін, у той час як у експериментальних тварин, яким вводили МШД, спостерігається поступовий розвиток морфологічних ознак його ушкодження.

Через 1 міс після введення антигену в серцевому м'язі цих тварин виявляли ознаки венозної гіперемії, дилатацію або спазматичне звуження просвітів частини інтрамуральних артерій та артеріол, нерівномірно виражений набряк інтерстицію міокарда з розширенням периваскулярних зон, помірне збільшення кількості клітин зовнішнього шару судинної стінки і оточуючої її сполучної тканини, а також окремі дрібні навколосудинні скупчення круглоклітинних елементів. Пучки вентрикулярних кардіоміоцитів (КМЦ) у цілому зберігали звичайну будову і орієнтацію. Коливання об'єму клітин скоротливого міокарда не виходили за звичайні межі. В деяких КМЦ при великих збільшеннях мікроскопа спостерігали нечіткість поперечної і поздовжньої посмугованості, а в поляризованому світлі – посилення або послаблення оптичної активності елементів контрактильного апарату. Міжфасцикулярні прошарки сполучної тканини за товщиною майже не відрізнялися від таких у контролі.

На другий місяць експерименту зміни в міокарді піддослідних тварин дещо збільшувалися. Розширені просвіти більшості венозних судин містили еритроцити зі значною кількістю агрегованих формених елементів. Стінки переважно дилатованих інтрамуральних артерій були помірно потовщені, їх адвентиція часто без визначеної межі переходила у сполучну тканину, що утворюється навколо судин. Проте, загалом, явища периваскулярного склерозу на цьому етапі експерименту мали початковий ступінь. У невеличких, переважно ексцентрично розташованих периваскулярних скупченнях рихлої сполучної тканини інколи утворювалися інфільтрати з елементів лімфоцитарно-гістіоцитарного ряду. Окремі пучки м'язових волокон набували локоноподібної звивистості. В КМЦ, частина яких збільшувалася за об'ємом, разом зі стертістю поздовжньої і поперечної посмугованості часто визначали дистрофічну зернистість саркоплазми. Клітини помітно різнилися за інтенсивністю фарбування еозином, інколи спостерігали пікринофілію, базофільну дегенерацію, футлярний, внутрішньоклітинний, міоцитолізис – розплавлення міофібрил зі збереженням "сарколемного футляра", що інколи передує колікваційному некрозу КМЦ, в разі якого відбувається колабування сполучнотканинних волокон, що попередньо існували, зазвичай без помітної реакції гістіо- і гематогенних клітинних елементів і лише в окремих випадках – з утворенням у фокусі такого пошкодження невеликих лімфо-гістіоцитарних інфільтратів.

На четвертому-п'ятому місяцях експерименту кількість дилатованих резистивних судин збільшувалася. Потовщення стінок і явища плазматичного просочування інтрамуральних артерій мали закономірний характер. Однак ми не спостерігали значного паравазального накопичення новоутворених волокнистих елементів. У нерівномірно розширених набряковою рідиною міжфасцикулярних щілинах часто спостерігали згрубілі прошарки перимізію. Ці зміни мали великозональний характер і були максимальними у субендокардіальних відділах серцевої стінки. На цих етапах експерименту пучки м'язових волокон з локоноподібною звивистістю зустрічалися частіше. Гіпертрофія або зменшення об'єму КМЦ визначали зростаючий поліморфізм скоротливого міокарда. На поздовжніх зрізах при відповідних збільшеннях спостерігали різну товщину і порушення звичайного розподілу елементів контрактильного апарату КМЦ, явища перинуклеарного набряку. Нерівномірність поперечної і поздовжньої посмугованості КМЦ була зумовлена десинхронізацією скоротливого циклу і розплавленням міофібрил, що у поляризованому світлі визначається посиленням або, навпаки, зниженням і втратою ними оптичної активності.

У більшості КМЦ ядра, що розташовані центрально, були дещо збільшені в об'ємі, мали рівні контури. В таких клітинах помітно просвітлена нуклеоплазма містила дрібні поліморфні брилки гетерохроматину та кілька ядерець. Разом з тим у значної частини КМЦ ядра мали пухирцеподібний вигляд і майже прозору нуклеоплазму. Іноді в них спостерігали грубобрильчасту конденсацію і субнуклеолемне розташування хроматину. Крім того, зустрічали поодинокі клітини з деформованими ядрами і без ядерець. У таких клітинах хроматин був зібраний у грубі поліморфні грудки, які містилися в оптично прозорій нуклеоплазмі. В окремих випадках визначали ознаки "подрібнення" ядра на гіперхромні брилки або вихід його вмісту у саркоплазму через пошкоджену нуклеолему. Останнє може бути свідченням апоптозної загибелі КМЦ.

На шостий місяць після введення специфічного білкового антигену в серці тварин піддослідної групи значно зростали явища венозного повнокрів'я, помітно збільшувалася частка дилатованих або спазмованих елементів артеріального коліна судинного русла серця. Крім того, частіше, ніж на попередніх етапах, зустрічалися судини зі значно потовщеною стінкою, структура якої зазнала гомогенізації через явища гіалінозу. Проте набряк інтерстицію залишався майже на тому ж рівні, що і в попередній серії спостережень.

Дистрофічні зміни в КМЦ часто поєднувалися з посиленням малюнка міжклітинних щілин через накопичення фуксинофільних волокнистих елементів по ходу кровоносних капілярів з ознаками пожвавлення клітини фібробластичного ряду, до яких інколи приєднуються гістоцити і круглоклітинні елементи. Разом з тим, переважно у навколосудинних зонах, спостерігали окремі дрібні лімфогістіоцитарні інфільтрати з незначним домішком плазмоцитів, а інколи – сегментоядерних лейкоцитів. Присутність таких клітин підтверджує наявність імунозапального компоненту у хронічному патологічному процесі, який відбувається в міокарді піддослідних тварин на цьому етапі експерименту.

Коливання об'єму КМЦ на більшості площини гістотопограм були приблизно в тих межах, що й на попередніх етапах. Проте явища внутрішньоклітинного набряку, поєднаного з лізисом контрактильних структур, зустрічали значно частіше. Стертість посмугованості робочих клітин міокарда та зменшення їх оптичної активності в поляризованому світлі також були більш поширеними. В той же час контрактурні зміни та фуксинорагія (при застосуванні методики J. Lie) або щільне чорне зафарбування залізним гематоксиліном спостерігали лише в окремих клітинах. Як і в попередній серії досліджень, характерним було збільшення об'єму ядер КМЦ з розправленням контурів нуклеолеми і просвітленням нуклеоплазми через її надлишкову гідратацію. Розташування хроматину у вигляді пилкоподібних брилок з кількома досить великими ядерцями при пошкодженні КМЦ змінювалося на грубобрильчасте з утворенням щільної базофільної смуги під нуклеолемою. Інколи конденсація хроматину поєднувалася з розривом ядерної оболонки і виходом його поліморфних брилок у просвітлену саркоплазму.

В окремих регіонах, переважно під ендокардом, з'являлися вогнища поширеного на десятки суміжних клітин лізису КМЦ. Це призводило до "ареактивної" без вираженої клітинної реакції депаренхіматизації міокарда з утворенням сітчастих рубчиків унаслідок спадання згрубілого ендо- і перимізію на місці КМЦ, що загинули. Разом з тим значно менша частина КМЦ зазнавала коагуляційного некрозу із зернисто-брильчастим розпадом клітин. У фокусах таких уражень серцевого м'яза спостерігали формування грануляційної тканини і поступове сполучнотканинне заміщення незворотно пошкоджених КМЦ та формування на їх місці зірчастих рубчиків, які у багатьох випадках зливаються між собою та тією чи іншою мірою зі склерозованими периваскулярними зонами.

На сьомий місяць після введення антигену зміни в міокарді різних тварин досить помітно відрізнялися. У половини мишей ділянки скоротливого міокарда, що раніше зазнавали гострих, інколи досить поширених альтеративних змін із заміщенням їх грануляційною тканиною, перетворюються на різні за розміром зіркоподібні рубчики. Це є головною морфологічною ознакою "імунозапальнозалежного кризу", що відбувся у попередній термін спостережень. У цих тварин активні структурні прояви спровокованого патологічного процесу практично нівелюються.

У 25 % мишей цієї ж групи помірні порушення інтрамуральної гемоциркуляції та гемотканинного гомеостазу рідини все ще зберігаються, на тлі чого виявляються дисеміновані дрібновогнищеві ураження КМЦ, інколи з утворенням окремих більш-менш значних круглоклітинних інфільтратів. Ще один морфологічний варіант судинно-тканинної реакції, що спостерігали також лише у 25 % піддослідних тварин, полягав у формуванні досить значних за об'ємом пошкоджень міокарда, подібних до описаних у попередній серії. Це може бути розцінено, як відстрочений прояв імунозапального процесу, що визначається індивідуальним рівнем імунореактивності тварин-реципієнтів.

На останньому, восьмому місяці, в міокарді всіх тварин спостерігали помірно виражені зрушення морфо-функціонального стану інтрамурального судинного русла та явища дифузного і вогнищевого кардіосклерозу. Лише в окремих спостереженнях у серцевому м'язі виявляють дрібні поодинокі фокуси свіжих альтеративних змін, що скоріше за все визначають не перманентний перебіг патологічного процесу, а прояви компенсаторної гіперфункції вентрикулярних КМЦ, спровокованої попередніми пошкодженнями скоротливого міокарда.

У попередніх дослідженнях ми показали, що морфологічна картина в міокарді експериментальних тварин, котрим вводили міозин, значно відрізняється залежно від антигену, який вводили мишам [2, 6, 7]. Отримані раніше результати показали, що інші антигени – зокрема 1) міозин, виділений з міокарда практично здорової людини, яка померла в результаті випадкової травми; 2) міозин, виділений з міокарда лівого передсердя хворих на ДКМП; 3) міозин, виділений з міокарда лівого шлуночка серця хворих, які померли від прогресуючої хронічної серцевої недостатності, зумовленої ішемічною хворобою серця та гіпертонічною хворобою, – спричиняють менш виражену пошкоджувальну дію на міокард та не є індукторами автоімунного пошкодження міокарда [2, 6, 7].

Результати попередніх досліджень також показали, що вже на 21-й і 52-й день після введення антигену МШД у серцевому м'язі тварин розвиваються гемоциркуляторні порушення і зворотні та незворотні дисеміновані пошкодження КМЦ, які близькі до морфологічних змін скоротливого міокарда, описаних при ДКМП у людини [1, 7] (Factor S.M., Sonnenblick E.H., 1985). Також було виявлено, що поширеність міоцитолітичних пошкоджень КМЦ у декілька разів перевищує поширеність сегментарних контрактурних пошкоджень як через 21, так і особливо через 52 дні від повторного введення антигену [7].

Надана робота є продовженням експериментальних досліджень, які були присвячені вивченню механізмів та особливостей морфологічних ушкоджень, спричинених введенням різних білкових антигенів. Ми продовжили строки спостереження для вивчення особливостей розвитку та прогресування морфологічних ушкоджень у міокарді мишей після введення останнім антигену МШД.

Результати проведеного дослідження ще раз підтвердили, що міозин, виділений з вентрикулярних КМЦ у хворих, померлих від ДКМП, є кардіотропним антигеном. Після введення цього білка в міокарді мишей поступово розвивається судинна реакція з інтерстиціальним набряком, дистрофічні та альтеративні зміни КМЦ, явища дифузного і дрібновогнищевого кардіосклерозу. У вентрикулярних КМЦ спостерігають пластичну недостатність з лізисними пошкодженнями контрактильного апарату. В окремих випадках в ядрах КМЦ визначають грубобрильчасту конденсацію хроматину і руйнування каріолеми. Останні зміни можна розглядати як ознаки апоптозу, але для підтвердження цього припущення потрібно провести подальші дослідження із застосуванням відповідних тестів.

Отримані дані показали, що найбільш значні зміни спостерігають через 6–7 міс після введення антигену МШД. Поширені дистрофічні зміни КМЦ і явища альтерації їх скоротливого апарату мають великозональний характер з переважною локалізацією у субендокардіальних ділянках серцевої стінки. Можна припустити, що погіршення тканинного дренажу, наявність в інтерстиціальній рідині продуктів тканинного дисметаболізму та пошкодження КМЦ мають подразнюючий вплив на ендотеліоцити мікросудинного русла, макрофаги та клітини сполучної тканини, посилюють секреторно-пластичну функцію фібробластів з тенденцією до збільшення кількості їх молодих форм. Це також стимулює міграцію круглоклітинних елементів з кровоносного русла в інтерстицій, де вони дифузно розсіюються та інколи утворюють дрібні навколосудинні скупчення.

Поступово в міокарді поряд з відносно мало зміненими регіонами формуються вогнища пошкодження КМЦ із заміщенням їх грануляційною тканиною, що дозріває до зірчастих рубчиків. Фокуси "депаренхіматизації" міокарда з колабуванням новоутворених сполучнотканинних структур або тих, що існували раніше, виявляють тенденцію до злиття між собою з об'єднанням у ділянки фіброзу. Заміщення вентрикулярних КМЦ сполучною тканиною разом з альтеративними змінами призводить до перерозподілу функціонального навантаження між робочими клітинами міокарда.

Виявлена в ці строки загальногістологічна картина дозволяє стверджувати про прогресуючий перебіг патологічного процесу в міокарді експериментальних тварин. На це вказує поліморфна картина пошкоджень КМЦ на тлі дисциркуляторних явищ, ознак порушення рідинного гомеостазу міокарда і прогресуючого кардіосклерозу. Все перераховане вище може розцінюватися як морфологічні ознаки реакції гіперчутливості сповільненого типу і визначати пролонгований, хронічний розвиток патологічного процесу після введення антигену МШД.

Висновки

Результати проведеного дослідження підтвердили, що міозин, виділений з міокарда лівого шлуночка серця хворих, що померли від дилатаційної кардіоміопатії, є кардіотропним антигеном.

Після введення міозину в міокарді у мишей поступово розвивається судинна реакція з інтерстиціальним набряком, спостерігають дистрофічні та альтеративні зміни кардіоміоцитів, явища дифузного і дрібновогнищевого кардіосклерозу. Найбільш значні зміни виявляють через 6–7 міс після введення антигену.

Загальногістологічна картина, що виявляється у ці строки, вказує на те, що індукований патологічний процес має пролонгований, хронічний характер і морфологічні ознаки реакції гіперчутливості сповільненого типу.

Література

1.Амосова Е.Н. Кардиомиопатии. – К.: Книга плюс, 1999. – 425 с.

2.Бобик В.І., Рябенко Д.В., Сергієнко О.В. та ін. Розробка експериментальної моделі аутоімунного міозин-індукованого пошкодження міокарда // Біополімери і клітина. – 2007. – № 2. – С. 115-121.

3.Сидорик Л.Л., Федоркова О.М., Рябенко Д.В. и др. Сравнительное исследование иммунореактивности тропонинового комплекса при дилатационной и ишемической кардиомиопатиях // Биополимеры и клетка. – 2000. – № 1. – С. 40-45.

4.Рябенко Д.В. Воспалительная кардиомиопатия: вопросы терминологии и лечения // Рациональная фармакотерапия. – 2008. – № 1(06). – С. 44-47.

5.Рябенко Д.В. Дилатационная кардиомиопатия. Часть 2. Вирусо-иммунологическая теория: трансформация вирусного миокардита в дилатационную кардиопатию // Укр. кардіол. журн. – 1998. – № 1. – С. 70-76.

6.Рябенко Д.В., Сидорик Л.Л., Бобык В.И. и др. Морфологические особенности аутоиммунного повреждения миокарда, обусловленного различными миокардиальными антигенами человека: сравнительное экспериментальное исследование // Укр. ревматол. журн. – 2000. – № 2. – С. 55-60.

7.Рябенко Д.В., Сидорик Л.Л., Сергиенко О.В. и др. Миозин-индуцированное повреждение миокарда: экспериментальное исследование // Укр. ревматол. журн. – 2001. – № 1. – С. 58-61.

8.Hare J.M. The dilated, restrictive, and infiltrative cardiomyopathies // Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardio-vascular Medicine / Еds. D.P. Zipes, P. Libby, R.O. Bonow, E. Braunwald. – 8th ed. – Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier, 2007. – chap. 64.

9.Huber S.A. Autoimmunity in myocarditis: relevance of animal models. // Clin. Immunol. Immunopathol. – 1997. – Vol. 83. – P. 93-102.

10.Karkkainen S., Peuhkurinen K. Genetics of dilated cardiomyopathy // Ann. Med. – 2007. – Vol. 39(2). – P. 91-107.

11.Luk A., Ahn E., Soor G.S., Butany J. Dilated cardiomyopathy: a review // J. Clin. Pathol. –2009. – Vol. 62. – P. 219-225.

12.Mestroni L., Gilbert E.M., Lowes B., Bristow M.R. Dilated cardiomyopathies // Hurt's The Heart / Еds. V. Fuster, R. O'Rourke, R.A. Walsh, P. Poole-Wilson. – 12th ed. – The McGraw-Hill Companies, Inc., 2008. – Part. 5.

13.Oakley C. Aetiology, diagnosis, investigation, and management of the cardiomyopathies // Brit. Med. J. – 1997. – Vol. 315(7121). – P. 1520-1524.

14.Towbin J.A., Bowles N.E. The failing heart // Nature. – 2002. – Vol. 415. – P. 227-233.

О.С. Гавриш, Д.В. Рябенко, В.І. Бобик, О.Ю. Маркелова, Л.Л. Сидорик.

• Національний науковий центр "Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска" АМН України, м. Київ;
• Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ