Основные методы лабораторной диагностики хламидийной инфекции кошек

Гончаров С.Б.

Ветеринарный врач

В последнее десятилетие интерес медицинских и ветеринарных специалистов многих стран мира привлекают хламидии, которые широко распространены среди различных видов животных, что обусловлено наличием неконтролируемого резервуара возбудителя инфекции в природе.[6] Хламидии способны вызвать заболевание более чем у 200 видов млекопитающих, а также у птиц и рептилий. Зараженные животные могут стать источником инфекции человека.[10, 24] Таким образом, хламидиоз является зооантропонозом, т.е. инфекционной болезнью общей для человека и животных.

Патология, вызываемая хламидиями, довольно разнообразна. У птиц встречаются респираторная, энтеральная и генерализованная формы.[15] У млекопитающих заболевания проявляются в виде энзоотических абортов, плацентитов, вагинитов и полиартритов.[3, 31] У человека эти микроорганизмы вызывают более 20 клинических синдромов, в частности, фарингиты, отиты, бронхопневмонии, миокардиты, артриты, поражение нервной системы и глаз, а также венерические гранулемы и урогенитальные поражения.[5, 6, 7, 8] Исследования, проведенные во многих странах в течение последних десяти лет, показали, что среди домашних животных – хламидиоз, в клинически выраженной форме, чаще всего встречается у кошек.[16, 17]

Возбудители болезни – Chlamydophila psittaci и Chlamydophila felis. Они относятся к одной из малоизученных групп микроорганизмов. Особенностью хламидий является способность при неблагоприятных условиях (некорректная терапия, и пр.) трансформироваться в латентные (L) формы, что сопровождается длительной персистенцией возбудителя и хроническим течением болезни. Это создаёт серьёзные трудности в диагностике и лечении заболевания, так как L-формы хламидий не чувствительны к антибиотикам и трудно диагностируются.[22] В латентной форме эти возбудители очень устойчивы к химическим и физическим воздействиям, в активной форме на них губительно действуют УФЛ, кипячение, 700C этиловый спирт и другие дезинфицирующие средства.[14, 20, 43]

Часто опасность заражения человека хламидиозом исходит от птиц, в особенности от попугаев и голубей. Штаммы хламидий, выделенные от птиц, считаются для человека особенно патогенными. Заражение происходит аэрогенным путем за счет вдыхания пыли, содержащей во взвешенном состоянии выделения и частицы перьев птиц, инфицированных хламидиями.[15, 27, 40]

В 1980-м году были описаны 20 случаев заражения человека хламидиями от млекопитающих. Кошки заражаются почти всеми штаммами возбудителя. Птицы и мыши, на которых они охотятся, являются природным резервуаром и первичным источником инфекции. Заражение человека происходит при тесном контакте с кошкой, у которой инфекция может протекать латентно.[33]

Этиологическая роль кошачьих хламидий пока до конца не выяснена, хотя в литературе имеются примеры зооантропонозной природы этой инфекций. Так, в США двадцатилетний мужчина заболел односторонним фолликулярным конъюнктивитом после того, как у его кошки проявились симптомы поражения конъюнктивы. Как у кошки, так и у её хозяина в конъюнктивальных мазках, взятых в этих случаях, были найдены тельца-включения, типичные для хламидий. Полагают, что антиген от кошки к человеку попал через нанесенные кошачьи царапины.[2]

В соответствии с решением юридической комиссии Международной ассоциации микробиологических обществ (МАМО), с 1980г. эти микроорганизмы получили родовое название Chlamydia. До 1989г. были известны только 2 вида хламидий - C.trachomatis и C.psittaci. С 1989г. выделяют третий самостоятельный вид хламидий - C.pneumoniae, а в 1993г. японскими микробиологами описан и четвертый вид - C.pecorum (Fukushi Н., Hirai К., 1993). По новой классификации речь идет о патогенных для человека микроорганизмах Chlamydia trachomatis, серовары D-K, принадлежащих в роду Chlamidia. К этому же роду относится также вид C.muridarum, патогенный для мышей и хомячков, и вид C.suis, инфицирующий свиней.[24, 33]

Хламидии являются грамотрицательными бактериями. Они имеют сходную с бактериями клеточную стенку, их генетический аппарат представлен нуклеиновыми кислотами – ДНК и РНК, чувствительны к антибиотикам, что сближает их с грамотрицательными бактериями.[32] Однако они не способны размножаться на искусственных питательных средах, и для репродукции им нужна живая чувствительная клетка как внутриклеточным микроорганизмам, что роднит их с вирусами.[41]

Хламидии обладают способностью блокировать механизмы иммунной защиты хозяина путем предотвращение слияния фагосомы с лизосомами. Благодаря этому клетки хозяина не только предохраняют инфект, но и способствуют их росту. Для размножения и роста внутриклеточные патогены используют питательные вещества и продукты жизнедеятельности клетки-хозяина. В процессе своего размножения хламидии разрушают цитоплазматические включения, выходят из клетки-хозяина во внешнюю среду и заражают новые клетки.[12]

Патогенез хламидийной инфекций может быть представлен в виде следую­щей схемы: хламидии являются внутриклеточными облигатными паразитами, обладают высоким политропизмом. Проникнув в организм аэрогенным, али­ментарным или половым путем, возбудитель первично размножа­ется в эпите­лиальных клетках слизистых оболочек и макрофагах. Затем внед­ряется в кровь и заносится практически во все внутренние органы, лимфатические узлы, сус­тавы и даже в головной и спиной мозг.[30]

Естественный цикл развития хламидий проходит в цитоплазматических включениях живых клеток (элементарное тельце ® ретикулярное тельце ® ретикулярные тельца ® промежуточные тельца ® элементарные тельца) и продолжается от двух до трех суток. Элементарные тельца ответственны за процесс прикрепления к клетке-мишени и проникновения в нее. Они устойчивы к факторам окружающей среды. Мелкие и оптически плотные элементарные тельца имеют ригидную клеточную стенку, жесткость структуры которой обеспечивается плотными дисульфидными связями основного белка наружной мембраны и двумя богатыми цистеином белками: белком оболочки и липопротеином наружной мембраны. Ретикулярные тельца – это большие, метаболически активные формы, синтезирующие ДНК, РНК и белки. Ретикулярные тельца являются высоко лабильными формами, которые не способны выжить вне клетки-хозяина.[42]

Хламидии проявляют выраженную чувствительность к действию коротковолновых и длинноволновых ультрафиолетовых лучей и высокой температуры. Элементарные тельца теряют свою инфекционность в 24-36 часов при 370С. Концентрированная суспензия хламидий инактивируется в течение 1 мин. при 95-1000С, через 10-15 мин. при 700С, через 30 мин. при 500С.

Установлена возможность сохранения инфекционности материала на хлопчатобумажных тканях до 2 суток при 18-190С.

Хламидии на стадии ретикулярных телец высокочувствительны к действию 70% этанола, 2% раствор лизола, 0,05% раствора нитрата серебра, 0,1% раствора йодида калия, 0,1% раствора перманганата калия, перекиси водорода, этилового эфира и инактивируются при комнатной температуре в течение 2 суток.[35]

Активная форма хламидиоза кошек – высококонтагиозная полисимтоматическая болезнь, проявляющаяся, чаще всего, об­щей слабостью, скованностью движений, повы­шен­ной температурой тела, конъюнктивитом, ринитом, отдышкой, гастритом, эндометритом, вагинитом. Реже встречаются поражения других органов и систем. При урогенитальной локализации хламидии вызывают аборты, мертворождения и бесплодие. Хламидиоз наи­более часто поражает котят в возрасте от 5-ти недель до 9-ти месяцев. Взрослые животные также могут заражаться, поскольку естест­венный иммунитет не продолжителен, имеет не высокую напряженность. Велика вероятность повторного заражения, так как гуморальные антитела, циркулирую­щие в крови, не могут защитить организм от реинфекции.[16]

Инкубационный период длится от 5 до 10 дней. В начале забо­левания обычно отмечают легкую лихорадку, длящуюся несколько дней. Заболевшие кошки обычно продолжают принимать корм и, как правило, чувствуют себя хорошо, проявляя лишь конъюнктивальный дискомфорт. Конъюнктивит начинается в большинстве случаев унилатерально (односторонне), выделение из глаза – сероз­ные. Через 10 – 17 дней поражается второй глаз. Конъюнктивит может продол­жаться от нескольких дней до нескольких месяцев, а иногда принимает хрони­ческое течение. По мере развития болезни конъюнктива становится более гипе­ремированной, а выделения – слизисто-гной­ными вследствие вторичной бакте­риальной инфекции.[38]

Поражение дыхательных путей часто проходит бессимптомно или со слабо выраженными признаками. Поэтому диагностировать хламидиозную пневмонию можно только гистологическими методами. Очаги поражения легочной ткани в виде мелких ограниченных гиперемированных участков со слабой аэрацией, располагаются преимущественно в периферических участках легкого рядом с бронхиолами.

Нарушение репродуктивной функции у кошек, включая аборты, отмечались довольно часто в кошачьих питомниках, где наблюдается эндемическое тече­ние болезни.

Внедрение хламидий в мочеполовой тракт редко сопровождается заметными клиническими проявлениями. Заболевание чаще бывает асимптомным или скрытым.

Диагностика хламидиоза кошек затруднена, поскольку многие клинические признаки присущи другим заболеваниям – калицивирусной и реовирусной инфекциям.[17]

Ни один из современных методов диагностики внутриклеточных патогенов не обеспечивает выявление возбудителя в 100% случаев. Поэтому лабораторная диагностика хламидий должна включать в себя сочетание не менее двух методов (прямых или непрямых).[23]

1. Методы прямого выявления бактерий:

· Микробиологическое исследование – выделение чистой культуры возбудителя;

· Цитологическое исследование мазков, окрашенных по методу Романовского-Гимза;

· Иммунологическое исследование – выявление антигенов возбудителя в мазках с помощью специфических антител (реакция прямой иммунофлуоресценции – РИФ), ДНК-зонды;

· Молекулярно-биологические методы – определение специфического участка ДНК/РНК в геноме возбудителя (полимеразная цепная реакция – ПЦР, лигазная цепная реакция – ЛЦР);

· Серологическое исследование – определение бактериальных антигенов (иммуноферментный анализ – ИФА);

· Методы экспресс-диагностики хламидий (иммунохроматография и ферментспецифическая реакция).

2. Непрямой метод, косвенно указывающий на наличие возбудителя у пациента:

· Серологическое исследование – определение специфических антител, образовавшихся в процессе иммунного ответа на микроорганизм (реакция связывание комплемента – РСК, реакция непрямой иммунофлуоресценции – РНИФ, иммуноферментный анализ – ИФА, реакция микроиммунофлуоресцинции – МИФ, рекомбинантный липополисахаридный ИФА – r-ELISA).[1, 18]

Методы прямого выявления хламидий.

Наиболее чувствительным, но трудоемким методом лабораторной диагностики является микробиологическое исследование. Для размножения in vitro хламидий необходимы клеточные линии млекопитающих. Для этой цели используют культуру клеток McCoy представляющую собой гибридные клеточные линии из человеческих синовиальных клеток и мышиных фибробластов, а также клетки Hela – перманентную клеточную линию из человеческой карциномы и L-299 – культуру клеток мышиных фибробластов.

Для C. psittaci наиболее эффективно применяют перманентную клеточную линию из почек африканской зеленой мартышки (BGM), в то время как для C. trachomatis клетки McCoy.

Критерием диагностического выделения хламидий служит выявление в инфицированных клетках типичных цитоплазматических включений в окрашенных препаратах при первичном заражении или в серии из 1-2 пассажей при отсутствии бактериальной контаминации.

При микробиологическом методе исследования возможно получение ложно-негативных результатов. Это происходит вследствие гибели возбудителя при нарушении правил забора биологического материала или во время его транспортировки в микробиологическую лабораторию.

Цитологический метод – метод непосредственной микроскопии - патологического материала (сос­коб с пораженной слизистой оболочки) был основным способом обнаруже­ния хламидий. При этом использовали окраску препаратов по Стемпу, Мак­киавелло и Романовскому-Гимзе. Окраска по Стемпу придает элементарным тельцам хламидии красно-фиолетовый цвет на синем фоне препарата; по Маккиавелло хламидии окрашиваются в ярко-красный цвет, клетки патоло­гического материала – в светло-синий, ядра клеток – в темно-синий цвет; по Романовскому-Гимзе элементарные включения хламидии приобретают красно- фиолетовый цвет, а ретикулярные тельца пораженной клетки – си­ний, ядро клеток – бордово-фиолетовый и их цитоплазма – голубой. Окра­шенные мазки исследуют с иммерсионной системой. Клеточные включения при микроскопии находят в виде скопления в цитоплазме вокруг ядра пора­женной клетки и образующих компактные включения в форме “ шапочки жандарма”. Включения могут располагаться в цитоплазме клетки диффузно. Цитологический метод в последнее время практически не используется, в связи с низкой чувствительностью – диагностировать хламидийную инфекцию у больных животных удается лишь в 10-12% случаев.[18]

Одним из самых распространенных методов диагностики является метод иммунофлуоресценции, позволяющие выявить цитоплазматические включения хламидий с содержащимися в них антигенами.

Прямой метод иммунофлуоресценции основан на выявлении хламидийных антигенов в клинических образцах от животных с помощью лиофилизированных моноклональных антихламидийных иммуноглобулинов, меченных флуоресцин-изотиоционатом (ФИТЦ), с синькой Эванса и азидом натрия.

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет диагностировать наличие элементарных телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые образования с ровными краями округлой формы. Размеры их составляют 1/100 от окружающих эпителиальных клеток.

В непрямом методе предусматривается непрямое окрашивания антигена, который соединяется на первом этапе реакции с немеченой антисывороткой животного, заведомо содержащей хламидийные антитела, а на втором этапе проводится окрашивание образовавшегося комплекса антиген-антитело за счет добавления меченной (антивидовой) сывороткой, содержащей конъюгированные с ФИТЦ антитела к глобулинам (антигенам) сыворотки, использовавшейся на первом этапе.

Получение ложно-негативных материалов может быть связано с нарушении правил забора биологического материала (отсутствие эпителиальных клеток в мазке). Ложно-позитивные результаты являются следствием неспецифического связывания антител с неинфекционным биоматериалом.

Метод полимеразной цепной реакций (polimerase chain reaction, PCR, ПЦР) или реакция энзиматической амплификаций, предложенная Кэри Б. Мюллисом (1983), стремительно вошел в практику и работу ученых, ведущих исследования в области биологии и медицины. ПЦР широко применяется для диагностики и типирования возбудителей хламидиозов, что связано со сложностью их культивирования.[19]

Достоинства ПЦР:

а) Быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при параллельной обработки 10-12 образцов;

б) Надежность;

в) Чувствительность;

г) Специфичность;

д) Для ПЦР пригоден любой материал, даже гистопрепараты.

Основные компоненты ПЦР:

а) термостабильный фермент ДНК-полимера;

б) пара олигонуклеотидных праймеров;

в) четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов;

г) копируемая ДНК;

д) ионы Mg2+ необходимые для функционирования ДНК-полимеразы;

е) буферные растворы для поддержания рН во время ПЦР между 6,8 – 7,8 и минеральное масло для предотвращение испарения.

Амплификатор – это прибор для проведения реакции в автоматическом режиме, обеспечивающем поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени.

Технология идентификации ДНК-содержащих вирусов заключается в следующем:

1) Из исследуемого материала выделяется ДНК-матрица

2) В пробирке смешивают ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимеразу

3) Пробирку со смесью нагревают до температуры денатурации ДНК (940С), при этом две цепи ДНК расходятся

4) Затем пробу инкубируют при температуре гибридизации праймеров с ДНК-матрицей (40-600С) в последующем

5) ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (720С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала

6) В последующем цикле синтез осуществляется с 4 копий, далее с 8 и т. д., до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови.

Индикация амплифицированного генетического материала проводится выше изложенным способом. В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации.[34]

Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами. Для этого необходимо использовать чистые перчатки, одноразовые пробирки и наконечники к автоматическим пипеткам, УФЛ и 700C спирт для обработки помещений и рабочих поверхностей столов и приборов.[13]

Несмотря на растущую популярность метода ПЦР он также, как и ПИФ небезупречен, поскольку при использовании высокочувствительной и специфичной ПЦР не исключены ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Если C. psittaci обнаружена методом ПЦР, то можно ограничится только этим исследованием. Мнение, что ПЦР даже при соблюдении всех технологических требований дает ложноположительные результаты вследствие контаминации в лаборатории, не подтверждается практикой, хотя были случаи, когда ПЦР давала положительный результат, а ПИФ – отрицательный. Именно такие случаи относятся к ситуациям так называемого «субъективного характера учета результатов», полученных методом иммунофлуоресценции.

Для обнаружения в исследуемом материале хламидий можно применить иммуноэнзимный метод (ELISA). При этом используют антитела, конъюги­рован­ные с ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.). При наличии в исследуемом материале хламидий, то есть положительная реакция антиген-антитело, высвобождается фермент, который действует на специально вводи­мый в реагирующую смесь субстрат. Образуется цветное соединение и по интенсивности цвета, определяемого с помощью спектрофотометра, судят о ко­ли­честве и наличии антигена в забранном материале (мазке, соскобе). Иммуно­энзимный анализ, как и реакция прямой иммунофлуоресценции, может дать положите­льный результат при наличии в забранном материале нежизнеспо­собных хла­ми­дий, а также других бактерий, имеющих перекрестно реаги­рующие антигены (некоторые грамотрицательные бактерии, риккетсии Провачека и др.). Ложно-негативные результаты являются следствием низкой концентрации антигена в исследуемых образцах. Причиной ложно-позитивных результатов может быть неспецифическое связывание антител с неинфекционным биоматериалом.[18, 34]

Методы непрямого выявления хламидий.

Эта группа методов позволяет избежать ложноотрицательных результатов при прямых методах и позволяет в ряде случаев определить стадию и характер течения заболевания. Это особенно важно при персистирующей инфекции, которая поддерживает хроническое течение на протяжении многих месяцев, повреждая и разрушая ткани и органы. Методы непрямого выявления бактерий особенно хороши, если возникают трудности при взятии материала для обнаружения антител.

В основе всех этих методов лежит выявление специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови и секретах инфицированного организма, в процессе иммунного ответа на внедрение возбудителя инфекционного заболевания. Антитела относятся к трем классам иммуноглобулинов: M, G и A. Накопление антител каждого из этих классов происходит через разные промежутки времени от начала иммунного ответа и зависит от характера инфицирования (первичное или повторное) [1, 6].

Регистрацию специфических антител можно проводить одним из иммунохимических методов. Наиболее эффективным являются методы микроиммунофлуоресцинции и рекомбинантного липополисахаридного ИФА, которые не требуют большого количества биологического материала и позволяют достаточно точно определить к какому классу относятся антитела. С помощью этих методов удается установить серологические критерии и стадии заболеваний.

Отрицательный результат серологического исследования не позволяет однозначно исключить хламидиоз, так как кроме серопозитивных встречаются и серонегативные формы этой инфекции. Выявление в крови только IgG к C. psittaci даже в высоком титре при отсутствии маркеров самого возбудителя в урогенитальном тракте не является основанием для установления диагноза. И наоборот, обнаружение IgA к C. psittaci – основание для постановки диагноза хламидиоза. Принципиального значения величина титра этих антител (IgA) и наличие или отсутствие маркеров самих хламидий в урогенитальном тракте не имеет.[18,19,39]