Подходы к профилактике и лечению птичьего гриппа

А.М.Котин

ЗАО « НПФ «Биофармтокс», ООО «Биофармос»

Введение.

В настоящее время 50-60% лекарств являются соединениями растительного происхождения или полусинтетическими препаратами на основе растительных ингредиентов. По оценкам экспертов к 2020 году доля таких лекарств достигнет 70-80%. Кроме того, существует великое множество биологически активных добавок, которые практически на 100% являются либо экстрактами лекарственных растений, либо в разной степени их очищенными соединениями. Экстракты лекарственных растений перекрывают весь спектр фармакологической активности и антивирусное действие не является исключением. Наибольшее количество работ по очевидным причинам посвящено ингибиторам ВИЧ-инфекции. К настоящему времени практически для каждого этапа процессинга этого вируса обнаружены специфические ингибиторы растительного происхождения. Другие РНК и ДНК содержащие вирусы, в том числе вирусы гриппа типов А, В и С, хотя и изучены с этих позиций в меньшей степени, чем ВИЧ-вирусы , но также имеют клинически и экспериментально доказанные многочисленные антагонисты в мире лекарственных растений.

Другим важным обстоятельством является неограниченность и доступность растительного фарм-ресурса, независимо от страны и континента произрастания необходимого лекарственного растения в связи с разработанными к настоящему времени биотехнологическими способами многотоннажного производства активной растительной биомассы - методами суспензионной культуры клеток растений в объемных биореакторах . Именно, таким способом получают в настоящее время наиболее ценные противоопухолевые препараты таксол, камптотецин и другие.

Мы полагаем, что использование природной и (или) биотехнологическим способом полученной растительной биомассы и получение на их основе специфических лекарств позволит также в глобальном масштабе решить проблему птичьего гриппа.

Генетические и антигеннные особенности «птичьего гриппа».

«Птичий грипп», подобно другим разновидностям вирусов гриппа типа А, содержит 8 отдельных сегментов РНК, кодирующих по крайней мере 10 белков. Такая структура вирусов гриппа объясняет почему эти вирусы склонны к рекомбинации или «реассортации», т.е. обмену сегментами . Если два вируса попадут в одну и ту же клетку, обмениваясь фрагментами, они могут породить до 256 различных разновидностей.

Поскольку доминирующей стратегией борьбы с вирусом гриппа была иммунологическая, те. Вакцинация населения, наибольшее внимание привлекали поверхностные антигены вириона – гликопротеины гемагглютенин и нейроаминидаза. Гемагглютенин отвечает за присоединение вируса в к сиаловой кислоте рецепторов на поверхности клеток, нейроаминидаза - за выход новых вирусных частиц из клетки и распространение вируса в организме, в зависимости от тропизма вируса: эпителиальные клетки дыхательных путей, слизистой кишечника и т.д.

В типе А вируса гриппа имеются субтипы, которые отличаются друг от друга особенностями гемагглютенина и нейроамидазы. Всего встречаются 16 разновидностей гемагглютенина и 9 разновидностей нейроамидазы ( neuroamidase -NA).

В птицах находят все возможные субтипы или комбинации этих белков, а у человека пока только три по гемагглютенину ( Н1, Н2 и Н3) и две по нейроамидазе (N1 и N2). Так Азиатский грипп ( эпидемия 1957 г, унесшая свыше миллиона жизней из них 72 000 в США) был H2N2 субтипа, а более поздний - Гонконговский ( эпидемия 1968-1969 гг. унесшая около 750 000 жизней из них 34 000 в США) принадлежал к Н3N2 cубтипу. Субтип печально известной «Испанки» ( эпидемии гриппа 1918 –1919 гг от которой погибли 25 - 40 млн человек - только 17 млн в Индии, 500 000 в США, 200 000 в Великобритании), произошел из «птичьего гриппа» H1N1.

Таким образом, в результате «реассортации» какая-либо разновидность гемагглютенина одного вируса объединяется с какой-либо разновидностью нейроамидазы другого. В результате возникает новый вирус с другими антигенными свойствами. Так азиатский вирус –H2N2 превратился в Гонконговский – H3N2. В таком же процессе может возникнуть комбинация этих двух белков, в результате которой вирус потеряет свою видовую специфичность и станет поражать другие виды. Сейчас известно, что новые вирусы с субтипами Н5, Н7 и Н9 могут преодолевать видовой барьер и передаваться от птиц к человеку, не имеющего иммунной устойчивости к новой разновидности гриппа. Так в Гонконге вирусом H5N1 были инфицированы 16 человек, 4 из которых погибли, Во Вьетнаме и Таиланде -погибли от этого вируса 23 человека в 2004г и 2 человека заражены в Северной Америке, в январе 2005 г во Вьетнаме зарегистрировано к настоящему времени свыше 40 смертей. Дискутируется возможность превращения H5N1 вируса в SARS –вирус, от которого погибли около 8000 человек в Азии, и т.д.

Таким образом, представление о непреодолимости «видового барьера» достаточно условно – это только вопрос времени ( а возможно и недостатка знаний). Так, оказалось, что «птичий грипп» H5N1 заражает не только свиней, лошадей ( что было известно ранее) но может поражать и домашних кошек, считавшимися ранее абсолютно устойчивыми к «птичьему гриппу». Последнее подтверждается не только фактами гибели кошек в Таиланде в период пандемии «птичьего гриппа» 2003 г ( существует даже мнение о том, что кошки сыграли определенную роль в распространении этого гриппа) гибелью, леопарда в зоопарке, у которых обнаружили тот же серотип H5N1, но и экспериментальными исследованиями на кошках ( Kuiken et al, 2004).

Так группа ученых в Медицинском центре Роттердама заражала кошек ( принято считать, что кошки абсолютно устойчивы к «птичьему гриппу») изолятами вируса, полученными из погибших от этого гриппа пациентов во Вьетнаме. В течение недели после заражение кошки погибали.. Две неинфицированные кошки, находившиеся в контакте с инфицированными, также заболели и погибли от воспаления легких, тогда как кошки, инфицированные вирусом гриппа человека – H3N2, признаков заболевания не проявляли. Таким образом, домашние кошки могут стать промежуточным переносчиком этой разновидности гриппа от птиц к человеку.

Таким образом, в результате «антигенного сдвига», могут возникать новые разновидности вируса гриппа А в том числе утратившие видовую специфичность. .

Исходя из представлений о цикличности таких превращений с интервалом в 20-30 высказано предположение, о том, что «реассортация» персестирующего штамма «птичьего гриппа» с человеческим ( например, H3N2 человека и H5N1 птиц образует H5N2 и т.п), породит вирус и эпидемию которая коснется не менее 20% населения Земли.

Однако, «реассортация» это не единственный путь возникновения субтипов вируса гриппа А с измененной антигенной структурой. Другой путь ( «антигенный дрейф») – накопление мутаций в поверностных белках – гемагглютенине и нейроаминидазе. Следует отметить, что частота мутаций в РНК-содержащих вирусах существенно превосходит таковую ДНК-содержащих, поскольку первые не имеют систему генетической коррекции ошибок при репликации. Поэтому накопление «ошибок» мутаций, из-за которых вирусы превращаются, как правило, во все более вирулентные формы, может происходить достаточно быстро

Подобное явление наблюдал H.Deng - ученый из Харбина, который в течение двух лет инокулируя мышам 21 изолят H5N1, полученные от инфицированных уток, наблюдал постепенное превращение вируса во все более и более патогенную форму. Вспомним, что «птичий грипп» H1N1 превратился в «испанку» не в результате реассортации, а накопив порядка 10 значимых мутаций. Мутации в гемагглютенине и нейроаминидазе могут изменять их антигенные свойства, в результате чего вирус избегает действия существующей вакцины. Этому, следует признать горькую правду, способствуют и антивирусные препараты. Например, большие ожидания были связаны с новым классом антивирусных средств - ингибиторами нейроаминидазы -- занамивира и осельтамивира ( см. разрекламированный Тамифлю), поскольку известные антивирусные средства аматидин и римантадин ( ингибиторы М2-белка ионных каналов вируса) против «птичьего гриппа» неэффективны, да и имеют многочисленные побочные эффекты, многие из которых весьма серьезны. Однако при использовании ингибиторов нейроаминидазы очень быстро возникают устойчивые к ним формы вирусов. В исследованиях японских авторов после 4-5 дней лечения 18-20% детей в возрасте от 2 месяцев до 14 лет имели устойчивые к этим препаратам вирусы, которые могли распространяться далее. Аналогично в культуре вируса гриппа типа В после пятого цикла размножения чувствительность вируса к действию осельтамивира упала в 7 раз, а к занамивиру в 90 раз ! ( Cheam ea,2004). Поэтому из-за «реассортации» и достаточно быстрых мутационных процессов вакцинирование полностью не исключает заболеваний. Так в США против обычного гриппа используется 75 млн доз в сезон подъема вирусных заболеваний. Но несмотря на компанию вакцинации вирус поражает ежегодно около 20 млн человек и убивает около 20 000, а еще большее количество людей госпитализируется по поводу гриппа и его осложнений. В другом серьезном исследовании гибель от гриппа в возрастной группе свыше 65-74 лет с 1968 по 2001 гг в зимнее время достигала 10% от всех смертей в этой группе независимо от вакцинации от вируса гриппа А: не было снижения смертности от вакцинации после 1980 г. Авторы считают, что значение вакцины сильно переоценено (Arch Intern. Med.2005; 165: 265-272 Lone Simonsen и др.). Кроме того, вакцинация в группах престарелых людей, детей, беременных женщин и пациентов с иммунологическими нарушениями порождает еще много проблем, которые широко обсуждаются в литературе.

Таким образом, помимо стратегии ускоренного создания вакцин, увеличения ее эффективности и безопасности, общей вакцинации и использования химических антивирусных средств должны быть разработаны дополнительные и альтернативные способы защиты от вируса гриппа, в том числе «птичьего»

Именно в этом случае, необходимо считаться с тем, что мутации изменяют не только антигенные сайты гемагглютенина и нейроаминидазы, но могут происходить во внутренних белках вируса, увеличивая его патогенность. При этом, накопление таких мутаций в определенных условиях может происходить очень быстро. Очень важные доказательства этому получены большой группой авторов (FASEB J/,2001,15:1846-1848 H.K. Nelson et al. Host nutritional selenium status as a driving force for influenza virus mutation), показавшими резкое увеличение частоты мутаций во внутреннем белке в условиях селен-дефицитного состояния организма и связонное с этим увеличение патогенности вируса.

В этих опытах использовали штамм вируса гриппа А/Bangkok/1/79 (H3N2) в эксперименте на мышах, часть из которых получала адекватную по селену диету, а другая – диету без этого незаменимого микроэлемента. Через пять дней после зарожения вирусы выделяли из легких мышей. Когда вирус, полученный из селен-дейфицитных мышей , вводили нормальным селен-адекватным мышам, тяжесть инфекции возрастала , тогда как вирусы из легких селен-адекватных мышей вызывали только слабые признаки заболевания.

Кроме того, авторы изучили последовательностей генов нейроаминидазы, гемагглютинина, внутреннего М-белка матрикса и М2-белка ионных каналов вируса . В то время как в генах поверхностных белков ( за 5 дней инкубации!) прошли по 1-2 мутации, приводящие к замене аминокислот, и частота их практически не различалась в изолятах вирусов из легких селен- адекватных и селен-дефецитных мышей, то, напротив в, гене М ( матрикса) у 2 из 3 изолятов насчитывали 29 мутаций , 7 из которых привели к замене аминокислот, а третьем изоляте из селен-дефицитных обнаружили еще пять дополнительных мутаций. В том же гене изолятов вируса из легких селен-адекватных мышей мутации не происходили. Не было мутаций и в гене М2. Таким образом, возможны состояния, связанные с диетологическими (экологическими) факторами, приводящими к повышению мутационного процесса в различных генах вируса, увеличивающих патогенность этих вирусов. Селен-дефицитное состояние ( или связанный с ним окислительный стресс, воспаление, дефицит восстановленного гшлютатиона и т.п) приводит к усилению мутационного процесса в вирусах. Следовательно важным фактором антивирусной защиты является снижение вероятности мутационного процесса в вирусной РНК, в частности за счет купирования селен-дефицитного состояния и окислительного стресса.

Именно мутация в 2002г во внутреннем белке вируса птичьего гриппа породила его ныне циркулирующую патогенную форму без изменения антигенной структуры вируса H5N1, те возник другой генотип вируса при той же антигенной конфигурации.

Мутация касается т.н. неструктурного белка гонконговского ( H5N1/97) вируса NS1 (nonstructural protein ), которой в значительном количестве обнаруживается в инфицированной клетке, но не в вирионе. Хотя имеются и другие мутационные различия и в других белках вируса, именно одиночная мутация - замена аспарагиновой кислоты на глютаминовую в 92 положении NS1 привела к появлению исключительно патогенной формы вируса. Так если этот мутировавший ген вставить в ранее безопасный штам вируса свиней, последний становится для них существенно более патогенным (

Функции NS –белка чрезвычайно разнообразны : активация трансляции вирусных белков через эукоритический активатор трансляции 4G1; снижение PKR-зависимого подавления вирусной репликации; подавление созревания (сплайсинга и транслокации) клеточной пре-мРНК за счет связывания с вирусными dsRNA и sRNA , торможение синтеза клеточных альфа/бета интерферонов по той же причине и подавления активации NF-kB, нарушение функций убиквитин-подобного белка, что препятствует нормальному протеолизу вирусных белков и другие.

Описанная мутация NS1 лишает NS- белок его антагонистических функций по отношению к клеточным интерферонам и каким-то образом приводит к гиперпродукции провоспалительных цитокинов, прежде всего фактора некроза опухолей TNF-alfa (теперь вместо tumor все чаще используют tissue, т.е. фактор некроза тканей).

Посмертное изучение людей, погибших от «птичьего гриппа» выявило в их тканях необыкновенно высокий уровень цитокинов – интерферона - a,b и TNF-alfa. Далее в первичной культуре макрофагов Mailik Peiris с коллегами в Гонконге показали что H5N1 индуцирует активный синтез TNF-альфа , вызывая таким образом токсический шок, подобный тому который вызывают липополисахариды грамм-отрицательных микроорганизмов ( Cheung CY ea, 2002. Induction of proinflamsatory cytokines in human macrophage by influenza a(H5n1) virusis; a mechanism for the unusuel severity of human disease? Lancet 2002; 360:1831-1837) Поэтому механизм поражающего действия гриппа птичьего типа H5N1 теперь описывают как «цитокининовый шторм»: инфицируя моноциты/макрофаги вирус вызывает нарушение регуляции цитокинов. Инициируется мультисистемный острый воспалительный процесс, связанный с иммунопатологическими эффектами фактора некроза тканей – TNF –alfa (Cheung ea,2002), который может нарушить целостность и функции практически всех органов. Полагают, что вирус “испанки” поражал, главным образом, ткани легкого, тогда как нынешний типа H5N1 поражает у человека не только легкие, но и головной мозг, почки , печень и другие органы. Так, коллектив из десяти авторов ( Mongkol Uiprasertkul и др.) у пациента с фатальным поражением H5N1 (после лечения) вирусную РНК действительно обнаружили в легких, слизистой и селезенке, тогда как позитивную вирусную РНК , указывающую на репликацию вируса, только в легких и слизистой. Вирусный антиген обнаруживался главным образом в легких, где и высокий уровень TNF-альфа, но не в других тканях ( слизистой, желудок, селезенка, мозг, костный мозг, почки, печень, поджелудочная) . Напротив, в другом описанном фатальном случае заражения H5N1 у 4 и 8 летних сестер вообще не было респираторного синдрома: у четырехлетней развилась тяжелейшая диаррея, после которой наступили судороги, кома и смерть, а у восьмилетней установлен диагноз гибели от острого энцефалита ( de Jong MD et al,2005). Таким образом, вирус может поражать различные системы органов с приемущественным поражением легочных тканей.

Следует указать на то, что по мнению ряда авторов высокая патогенность «испанки» также была связана со способностью вируса индуцировать гиперпродукцию цитокинов. Так при конструировании вируса, в котором гемагглютинин брали от вируса 1918 года, в легких экспериментальных мышей обнаружили высокий уровень хемокинов и цитокининов макрофагального происхождения, тогда как при введении обычного вируса гриппа болезнь не развивалась ( Kobasa D et al, 2004). Патогенетический механизм, связанный с гиперпродукцией воспалительных цитокинов, присущ не только вирусам гриппа H5N1, но и ряду других: SARS, гепатиту С ( Kalinovski ea 1998), , ДНК-содержащим вирусам ( например, вирус лихорадки африканских свиней ( M.Gomez del Moral et al,1999) и др, равно как бактериальным и паразитарным инфекциям (Ian A. Clark,Lisa M. Alleva, Alison C. Mills, and William B. Cowden Pathogenesis of Malaria and Clinically Similar Conditions. Clinical Microbiology Reviews, July 2004, p. 509-539, Vol. 17, No. 3)

2. Защита от гриппа растительными препаратами

Таким образом, защита от «птичьего гриппа» намного сложнее, чем от обычного гриппа человека. Как мы видели, вирус гриппа подтипа А «выработал» популяционную стратегию избегать вакцину через изменение антигенной структуры через «реассортацию» и накопление мутаций в гемагглютенине и нейроамидазе. Новая стратегия «птичьего гриппа» связана с уходом от действия цитокининовых факторов поражения вирусов – интерферонов и TNF-альфа.

Более того, при инфекции возникает острый воспалительный процесс, связанный с их гиперпродукцией провоспалительных цитокиноав и, прежде всего, фактора некроза опухолей ( фактора некроза тканей). Действие этого разрушающего некоторые опухоли фактора зависят от его концентрации. Умеренные концентрации усиливают фагоцитарную активность микро- и макрофагов крови, стимулируют синтез многих интерлейкинов, активируют Т- и В-клетки, стимулируют образование антител и синтез колонеобразующих факторов, потенцирует лизис вирусинфицированных клеток, участвуют в регуляции множества функций ЦНС, в том числе сна. В больших же концентрациях, в сотни раз превосходящих нормальные, фактор некроза опухолей, напротив, ингибирует стволовые клетки, резко снижает иммунитет, нарушает сердечно-сосудистую деятельность, повышает температуру тела, вызывает апоптоз многих клеточных популяций, в том числе в лимфоидных органах, увеличивает проницаемость сосудов, активирует сосудистый эндотелий, способствует микротромбообразованию, вызывая гемморогические повреждения, шок, гибель. Фактор некроза опухолей продуцируется активированными макрофагами, Т и В лимфоцитами, NK-клетками, астроцитами, эндотелиальными клетками, некоторыми опухолевыми и мышечными, но, главным образом, в активированных моноцитах и макрофагах, которые синтезируют также такие противоспалительные цитокины как интерлейкин-1 (IL-1) и интерлейкин-6 ( IL-6). Следовательно, новая стратегия, среди прочего, должна быть направлена и на подавление избыточного синтеза провоспалительных цитокинов и на предотвращение их патогенного действия на ткани ( но не на вирусы). К счастью, это уже хорошо изученная область, поскольку патогенетические механизмы связанные с гиперпродукцией TNF-альфа хорошо исследованы в онкологии, лечении псориаза, всевозможных воспалительных процессов, механизмах старения и т.д.

Выявление основной или главенствующей роли TNF-альфа в патогенезе H5N1 (а также в значительной группе других вирусных заболеваний , равно как и при инфекциях грамм-отрицательными микроорганизмами, некоторыми простейшими ) подсказывает возможные пути терапии этих заболеваний, так как известно огромное количество ингибиторов провоспалительных цитокинов, в том числе весьма специфичных. Действительно, снижение тяжести вирус-индуцированных легочных заболеваний подавлением гиперпродукции TNF-альфа были показаны в эксперименте на мышах ( Hussel et al., Inhibition of tumor necrosis factor reduces the severity of virus-specific lung immunopathology. Eur.J.Immunol 2001;31:2566-73) и в клинике (Yanik et al., Etanercept (Enbral) administration for idiopathic pneumonia syndrome after allogeneic hematopoetic stem cell transplantation . Diol Blood Marrow Transplant 2002; 8:395-400). В этой связи, естесвенно, не прошла без внимания исследователей и возможность сочетанного подхода к лечению гриппа совмещением ингибиторов вирусной нейроаминидазы (осельтамивира) и и ингибитора синтеза TNF-альфа ( см. патент США 6б419б934 , 2000, E.Tobinic TNF-alfa inhibition for potential Therapeutic Modulation of SARS Coronovarus infection. Curr Med.Res.Opin. 20(1):39-40,2004).

Среди всевозможных ингибиторов синтеза воспалительных цитокинов и, прежде всего TNF-альфа, наиболее привлекательны в силу низкой токсичности соединения растительного происхождения, в частности, фенольные антиоксиданты ( Qiang Ma et al., 2003), всем известный силимарин ( и др. ) . Экстракты лекарственных растений имеют еще то преимущество, что наряду с противовоспалительной активностью, одновременно могут содержать и прямые ингибиторы вируса гриппа. Так ингибиторы нейроаминидазы обнаружены в растениях, которые использовались тысячелетиями. Например, ингибиторы нейроаминидазы вирусов гриппа А и В типов: байкалеин ( 5,6,7-тригидроксифлавон) и байкалин ( 7-D-глюкуроновая кислота-5,6-дигидроксифлавон) выделены из шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis), вогонин ( 5,7-дигидроксифлавон) из пассифлоры ( Passiflora incornata), эмодин, 3-метиловый эфир эмодина , омега-гидроксиэмодин и транс-ресверетрол из Reynoutria elliptica ( Lee ea, 2003), наконец, бензойная кислота ( Atigadda ea,1999; Wang, Wade, 2001) из клюквы. Именно производные бензойной и сиаловой кислот в настоящее время рассматриваются как потенциальные противовирусные лекарственные средства – ингибиторы нейроаминидазы/сиалидазы вирусов гриппа ( Antigadda ea,1999, Wang ea., 2005). Исключительно интересный случай представляет изучение антигриппозногот действия ресверетрола, посколько это соединение одновременно обладает высокой антиоксидантной, нейроаминидазной активностями и способностью прямо ингибировать созревание вирусов гриппа А ( а также цитомегаловируса) ( Pasick ea , 2005).

Число известных растений с вероятным прямым действием на различные этапы размножение вируса гриппа достаточно велико(Achillea millefolium, Bombax ceiba, Sambucus nigra, Scutellaria baicalensis, Plantago major,Geranium sanguineum, Salix alba, См. обзоры и статьи: Chen ea 2005. Chinase medicinal herbs for influenza (39 refs) Cochrane Database of Systemic Reviews Lau et al. The use an herbal formula by hospital care worker during the severe acute respiratory syndrome epidemic in Hong Kong to prevent severe acute respiratory syndrome transmission, reliev influenza-related symptoms, and impruve quality of life: a prospective cohort stdy. J. Alternative and Complementary Medicine. V.11(1)49-55.

Очевидно, что следующим шагом, в усилении терапевтического действия растительных экстрактов, должно стать совмещение их прямого действия на репликацию вируса ( например, ингибиторования нейроаминидазы) и подавляющей синтез TNF-alfa активности ( окислительного стресса, острого воспалительного процесса), с выраженными антимутагенными свойствами, с предотвращением селен-дефицита ( глютатионвосстанавливающей активности) и способности препятствовать вторичным инфекциям.

Источник: www.vitagmal.ru