Діагностичне значення сульфгідрильних і дисульфідних груп у хворих з гострим коронарним синдромом.

Науковий інтерес щодо дослідження сульфгідрильних (–SH) і дисульфідних (–S–S–) груп у кардіології, перш за все, пов’язаний з їх значенням у структурно-функціональній організації білків, низькомолекулярних тіолів, а також у регуляції окиснювально-відновної рівноваги і метаболічних процесів [7, 11, 12, 16]. На наш погляд, суттєвим для вдосконалення діагностичних стандартів у кардіології є дані літератури про наявність груп –SH в активному центрі креатинфосфокінази (КФК) і її МВ-фракції (КФК-МВ) [5], у структурно-функціональній організації тропоніну [2], міоглобіну [9] та низькомолекулярних тіолів: гомоцистеїну, цистеїну і глутатіону [7, 11, 12, 16]. На сьогодні визначення цих білкових і низькомолекулярних сполук вважається найбільш інформативним у разі ішемічної хвороби серця (ІХС) [1, 5, 13]. Активно вивчають причинний зв’язок порушення метаболізму тіолових сполук з розвитком атеротромбозу [10, 13–15], але поки ще чітко не визначена функціональна роль у цих порушеннях груп –SH і –S–S– та їх діагностичне значення у хворих з гострим коронарним синдромом (ГКС).

Мета роботи – з’ясувати особливості функціонального стану білкових і небілкових груп –SH і –S–S– і обґрунтувати їх діагностичне значення за різних клінічних форм гострого коронарного синдрому.

Матеріал і методи

В обстеження залучено 102 пацієнти (чоловіків – 86; жінок – 16) віком від 28 до 65 років з ГКС, що перебували на стаціонарному лікуванні у відділенні кардіореанімації Військово-медичного клінічного центру Південного регіону (м. Одеса). Всіх хворих обстежували у період до 6 год від початку ангінозного нападу. Остаточний діагноз встановлювали на підставі даних клінічного, електрокардіографічного і біохімічного (рівні КФК-МВ, кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну) досліджень [1, 5], що відповідало Європейським рекомендаціям з діагностики і лікування ГКС [3]. В результаті ретроспективного аналізу даних хворих розподілили на три групи з остаточно сформованим клінічним діагнозом. Перша група – 49 пацієнтів з нестабільною стенокардією (НС), визначеною на підставі клінічних симптомів, а також ознак транзиторної депресії сегмента SТ і змін зубця Т не менше ніж у двох відведеннях на ЕКГ. При цьому, показники активності КФК-МВ, вмісту кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну вкладалися в межі референтних значень. Друга група – 27 пацієнтів, у яких розвинувся гострий інфаркт міокарда (ГІМ) без зубця Q. Поряд із клінічними симптомами у цих хворих найчастіше виявляли більш стійку депресію сегмента SТ, порушення морфології зубця Т і відсутність зубця Q на ЕКГ. При цьому мали місце типове підвищення активності КФК-МВ, рівня кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну, які перевищували референтні значення відповідно у 3,9; 4,4 і 80 разів. Третя група – 26 пацієнтів, у яких розвинувся ГІМ із зубцем Q. Про це свідчили клінічні симптоми, ознаки ішемії міокарда на ЕКГ (нова елевація сегмента SТ у точці J принаймні на 0,2 мВ у відведеннях V1-VЗ і на 0,1 мВ в інших відведеннях, зміна зубця Т), а також ознаки некрозу міокарда, зокрема конфігурації комплексу QRS. Клінічно сформований інфаркт міокарда у цих пацієнтів характеризувався появою зубця Q у будь-якому відведенні від V1 до V3, або зубця Q тривалістю 0,03 с у відведеннях І, II, аVL, аVF, V4, V5 або V6. У цих хворих мало місце типове підвищення активності КФК-МВ, рівня кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну. Кратність їх підвищення була відповідно у 4,8; 6,8 і 157 разів.

У дослідження включено лише тих хворих з ГКС, у яких клінічний наслідок захворювання був сприятливий. На догоспітальному етапі практично всі пацієнти отримували: валідол, нітрати, ненаркотичні і/або наркотичні аналгетики, гепарин, сибазон, ацетилсаліцилову кислоту тощо.

Для з’ясування референтних значень показників, що вивчаються, обстежено контрольну групу – 100 практично здорових добровольців і донорів крові (чоловіків – 92 і жінок – 8) віком 20–65 років, без клінічних, електрокардіографічних і лабораторних ознак ІХС.

Дослідження активності ферменту КФК-МВ проведено на автоматичному біохімічному аналізаторі Cobas Mira Plus (Швейцарія) з використанням наборів реактивів фірми Lachema (Чехія). Вміст кардіоспецифічного тропоніну I вивчено методом імуноферментного аналізу з використанням тест-систем Biomerica Inc. (США) і Sanofi Diagnostics Pasteur (Франція). Вимірювання оптичної щільності зразків при довжині хвилі 450 нм здійснювали на багатоканальному вертикальному фотометрі Sanraise виробництва Tecan (Австрія) і LP 400 виробництва Sanofi Diagnostics Pasteur (Франція). Вміст міоглобіну визначали у реакції прямої гемаглютинації з використанням еритроцитарного діагностикуму ("ДС-эритромиоглобин", Росія).

Вміст білкових і небілкових груп –SH визначали в сироватці крові методом зворотного амперметричного титрування [11] в модифікації [6]. Аналогічним методом визначали вміст груп –S–S– після попереднього розщеплення дисульфідних зв’язків насиченим розчином сульфіту натрію. Небілкову фракцію сироваток крові отримували шляхом їх депротеїнізації розчином метафосфорної кислоти (10 %) [6]. За відношенням відновлених (–SH) і окиснених (–S–S–) функціональних груп розраховували білковий і небілковий тіол-дисульфідний коефіцієнти (SH/SS), значення яких відображають окиснювально-відновну рівновагу у тіол-дисульфідній системі: R–SH R–S–S–R [11, 13, 14].

Статистичну обробку даних проводили за порівнянням вибіркових середніх величин (M±m), з використанням t-критерію Стьюдента. За рівень статистичної значущості приймали Р<0,05.

Результати та їх обговорення

Виявлено, що в сироватці крові осіб контрольної групи кількість білкових груп –SH і –S–S– переважала над вмістом небілкових груп –SH і –S–S–. При цьому, функціональна активність білкових груп –SH була вищою, ніж білкових груп –S–S–, а небілкових груп –SH – нижчою, ніж небілкових груп –S–S–, тому показники білкового і небілкового SH/SS коефіцієнтів були відповідно > 1 і < 1.

У всіх хворих у період до 6 год від початку ангінозного нападу встановлено однакову спрямованість порушення вмісту білкових і небілкових груп –SH і –S–S–. Вона полягала у достовірному зниженні вмісту білкових груп –SH та підвищенні рівня білкових груп –S–S– і, навпаки, в підвищенні вмісту небілкових груп –SH та зниженні рівня небілкових груп –S–S– у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та із зубцем Q порівняно з аналогічними показниками осіб контрольної групи. Необхідно зазначити особливості порушення співвідношення між вмістом груп –SH і –S–S– у сироватці крові хворих, про що свідчили показники білкового і небілкового коефіцієнтів SH/SS. Так, встановлено, що у хворих на НС та пацієнтів з ГІМ без зубця Q, як і в осіб контрольної групи, показник білкового коефіцієнта SH/SS був > 1, що обумовлено переважанням вмісту білкових груп –SH над рівнем білкових –S–S–. Проте, як у хворих на НС, так і у хворих на ГІМ без зубця Q білковий коефіцієнт SH/SS був вірогідно нижчим, ніж у осіб контрольної групи. У хворих на НС і з ГІМ без зубця Q, як і в осіб контрольної групи, показник небілкового коефіцієнта SH/SS, навпаки, був < 1. Це означає, що вміст небілкових груп –S–S– преважає над рівнем небілкових груп –SH. Поруч з цим як у хворих на НС, так і у хворих на ГІМ без зубця Q небілковий коефіцієнт SH/SS був вірогідно вищим, ніж у осіб контрольної групи. На відміну від хворих на НС і пацієнтів з ГІМ без зубця Q, у всіх хворих з ГІМ із зубцем Q спостерігали "інверсію" білкового і небілкового коефіцієнтів SH/SS, тобто докорінну зміну порядку співвідношення між вмістом груп –SH і –S–S– на зворотний. Це було пов’язано із занадто різким зниженням вмісту білкових груп –SH і підвищенням рівня білкових груп –S–S–, і навпаки, занадто різким підвищенням рівня небілкових груп –SH і зниженням вмісту небілкових груп –S–S–. Тому білковий і небілковий коефіцієнти SH/SS у хворих на ГІМ із зубцем Q були відповідно < 1 і > 1. Встановлено також, що наростання порушень функціонального стану груп –SH і –S–S– вірогідно збільшується залежно від характеру структурно-функціональних пошкоджень міокарда відповідно до тяжкості клінічного перебігу захворювання: НС ГІМ без зубця Q ГІМ із зубцем Q у період до 6 год від початку ангінозного нападу.

Обговорюючи результати, перш за все, необхідно зупинитися на даних, отриманих при обстеженні осіб контрольної групи. Закономірності функціонування білкових і небілкових груп –SH і –S–S– можна пояснити структурними властивостями атома сірки в білках і низькомолекулярних тіолах, наведеними в роботах [10–12]. Завдяки цим властивостям, групи –SH залишків цистеїну у білках відрізняються найбільш високою здатністю до реакції і різноманітністю хімічних перетворень, а реакції, в які вступають групи –S–S– цистеїну в білках, не такі різноманітні, як реакції груп –SH. Стійкість зв’язків –S–S– до різних взаємодій за фізіологічних значень рН і температури добре відповідає їх основній функції – участі в стабілізації макромолекулярної структури білків [12]. Тому групи –SH роблять значний внесок у здатність білків до реакції, а групи –S–S– – у стабілізацію структури білкових молекул, а отже, і в реалізацію їх біологічних функцій. Описаними вище процесами пояснюється переважання рівня білкових груп –SH над вмістом білкових груп –S–S– у сироватці крові осіб контрольної групи.

Закономірності функціонування небілкових груп –SH і –S–S– в контрольній групі можна пояснити структурними властивостями низькомолекулярних тіолів (глутатіону, цистеїну, гомоцистеїну та ін.). У природі вони існують у двох формах – відновній (R–SH) і окисненій (R–S–S–R) і переважають не в плазмі крові, а у всіх клітинах, де відбувається ферментативне відновлення дисульфідів [7]. За фізіологічних умов проникність клітинних мембран для низькомолекулярних тіолів незначна, однак їх "міграція" в периферичну кров все ж таки відбувається. У плазмі крові ферментативне відновлення дисульфідів практично не відбувається, тому в ній лише 1 % тіолів низької молекулярної маси існує у вигляді відновної (R–SH) форми, близько 70 % утворюють змішані дисульфідні зв’язки з білками (R–S–S–Р), особливо з альбуміном, і майже 30 % – це дисульфіди низької молекулярної маси (R–S–S–R) [13]. Причому утворення змішаних дисульфідних зв’язків забезпечує можливість енергетично вигідної підтримки гомеостазу антиоксидантів, що містять ці функціональні групи, без активації їх біосинтезу [7]. Процесами, описаними вище, пояснюється переважання рівня небілкових груп –S–S– над вмістом небілкових –SH у сироватці крові осіб контрольної групи. У цілому, результати, отримані в контрольній групі, свідчать про збалансоване функціонування білкових і небілкових груп –SH і –S–S–, що обумовлено стабільним структурно-функціональним станом білків (ферментів) і низькомолекулярних тіолів, а також фізіологічним рівнем їх міграції з клітин у периферичну кров. Значення цих показників в осіб контрольної групи практично збігаються з даними інших авторів [4, 6], тому їх прийнято за референтні.

Особливості функціонування білкових і небілкових –SH і –S–S– груп у хворих можна пояснити таким чином. Згідно з даними літератури [10–12], порушення вмісту білкових груп –SH і –S–S– може опосередковуватися конформаційними перебудовами білків, зміною їх іонного оточення і гідрофобними взаємодіями. На наш погляд, конформаційні перебудови білків обумовлені їх окиснювальною модифікацією, про що свідчать зниження вмісту білкових груп –SH і підвищення кількості білкових груп –S–S– у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та з ГІМ із зубцем Q, а також зниження білкового коефіцієнта SH/SS у хворих на НС, ГІМ без зубця Q та "інверсія" білкового коефіцієнта SH/SS у хворих з ГІМ із зубцем Q.

Підвищення вмісту небілкових груп –SH і зниження кількості небілкових груп –S–S– у сироватці крові хворих можна пояснити: по-перше, порушенням у клітинах (у тому числі ендотелію і міокарда) метаболізму низькомолекулярних тіолів, які містять ці функціональні групи [13–15], підвищеною "міграцією" їх з пошкоджених клітин у периферичну кров [7] та затримкою виведення з організму [13]: по-друге, конформаційними перебудовами білкових молекул, що супроводжуються відновленням змішаних дисульфідних зв’язків з білками (R–S–S–Р), а також відновленням дисульфідів низької молекулярної маси (R–S–S–R) [7, 11, 16]. На це вказують підвищення вмісту небілкових –SH і зниження кількості небілкових груп –S–S– у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та з ГІМ із зубцем Q, а також підвищення небілкового коефіцієнта SH/SS у хворих на НС, з ГІМ без зубця Q та "інверсія" небілкового коефіцієнта SH/SS – у хворих на ГІМ із зубцем Q.

Розбалансування окиснювально-відновних R–SHR–S–S–R перетворень у білках і низькомолекулярних тіолах взагалі може бути обумовлено їх імунним ушкодженням [6]. Ці процеси пов’язані з ерозією і розривом атеросклеротичної бляшки, тромбозом вінцевих артерій і мікроемболією, а також коронарною вазоконстрикцією і інфарктом міокарда, які є спільною патофізіологічною основою загострення ІХС [1]. Тому за динамікою зміни вмісту білкових і небілкових груп –SH і –S–S– можна своєчасно зафіксувати наростання активності системи зсідання і пригнічення системи фібринолізу у хворих. Таке припущення підтверджують наші дослідження, згідно з якими наростання порушень функціонального стану білкових і небілкових груп –SH і –S–S– вірогідно збільшувалося залежно від характеру пошкодження міокарда у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та ГІМ із зубцем Q. Крім того, в літературі наведено важливу роль систем зсідання–фібринолізу у формуванні пулу плазмових і сироваткових білків, які містять групи –SH залишків цистеїну і групи –S–S– цистеїну [10]. З порушенням метаболізму гомоцистеїну і цистеїну пов’язують формування оксидативного, метаболічного, судинно-тромбоцитарного і коагуляційного компонентів атеротромбозу [13–15]. Встановлено також, що у хворих на стенокардію порушення властивості органічних нітратів зв’язуватися з групами –SH відіграє важливу роль у розвитку толерантності до нітратів [8].

На нашу думку, до неспецифічних факторів, які суттєво впливають на активність ферменту КФК-МВ, рівень міоглобіну і кардіоспецифічного тропоніну I, гомоцистеїну і цистеїну, які в основному порушені у хворих на ГІМ із зубцем Q та без зубця Q [1, 13, 15], можна віднести розбалансування окиснювально-відновних перетворень R–SHR–S–S–R у цих сполуках. Це підтверджують дослідження авторів [6, 7, 10–12, 14, 16], згідно з якими у інактивації і реактивації білків (ферментів), антитіл тощо відіграє важливу роль окиснювально-відновний стан сироватки крові, який значною мірою залежить від співвідношення між вмістом груп –SH і –S–S– у білках і низькомолекулярних сполуках. З урахуванням одержаних результатів, автор не виключає, що застосування інших реагентів та методів для визначення груп –SH і –S–S– [11, 12] може сприяти більш поглибленому вивченню їх ролі в розвитку метаболічних порушень за умов загострення ІХС та вдосконалення методів діагностики і лікування.

Зупинимося на доцільності використання показників функціонального стану груп –SH і –S–S– та їх діагностичної інформативності у хворих із серцево-судинними захворюваннями. На сьогодні вважається аксіомою, що найбільш інформативними біохімічними тестами виявлення некрозу міоцитів є підвищення активності ферменту КФК-МВ, вмісту міоглобіну і тропонінів у плазмі крові, природно за наявності клінічних ознак ішемії [1]. Проте для розв’язання численних проблем, що стоять перед практичною кардіологією, завжди необхідне поєднання різних за принципом, чутливістю, швидкістю і способами реєстрації методів. У цьому аспекті метод амперметричного титрування дозволяє проводити комплексну оцінку показників функціонального стану груп –SH і –S–S–, причому тривалість дослідження і отримання результатів становлять близько 1–2 хв [11, 12]. Це набуває особливої значущості, враховуючи важливість чинника часу в діагностиці і обґрунтуванні терапії при ГКС. Між тим, ці показники доцільно використовувати лише як додаткові клініко-лабораторні тести для об’єктивізації діагнозу, а клінічна інтерпретація їх обов’язково повинна проводитися в контексті інших диференціальних діагнозів. Хоча ішемія вінцевих артерій супроводжується описаними вище особливостями функціонального стану груп –SH і –S–S–, проте, згідно з даними літератури [11], вона є лише однією з безлічі причин зміни їх вмісту. Незалежно від цього, наростання порушень показників вказує на менш сприятливий прогноз, ніж якби вони були в нормі. Тому, коли немає клінічних даних, які дають можливість припустити наявність ішемії вінцевих артерій, необхідно проводити пошук інших причин. У зв’язку з цим інтерпретація порушень функціонального стану груп –SH і –S–S– у хворих із серцево-судинними захворюваннями повинна обов’язково здійснюватися із урахуванням загальної клінічної картини.

Крім того, накопичені експериментальні та клінічні дані [2, 3, 6, 10, 11, 13, 14], які свідчать, що вплив на організм екстремальних чинників призводить до однотипних, хоча і кількісно відмінних, змін вмісту тіол-дисульфідних груп, у тому числі при ГКС. Тому розлади вмісту і співвідношення білкових та небілкових груп –SH і –S–S–, що спостерігають у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та з ГІМ із зубцем Q, слід розглядати як можливі складові у порушенні універсального неспецифічного механізму захисту організму хворих до ушкоджувальних чинників.

Висновки

У хворих на нестабільну стенокардію, гострий інфаркт міокарда без зубця Q та із зубцем Q у період до 6 год від початку ангінозного нападу встановлено вірогідне зниження вмісту білкових груп –SH та підвищення рівня білкових груп –S–S– і, навпаки, підвищення вмісту небілкових груп –SH та зниження рівня небілкових груп –S–S– порівняно з аналогічними показниками осіб контрольної групи.

Зниження білкового і підвищення небілкового коефіцієнтів SH/SS при загостренні ішемічної хвороби серця пов’язано з порушенням співвідношення між вмістом груп –SH і –S–S–, як у білках, так і низькомолекулярних тіолах, що побічно свідчить про конформаційні перебудови цих сполук і підвищену міграцію їх з пошкоджених клітин у периферичну кров.

Розлади тіол-залежного окиснення, вмісту і співідношення білкових та небілкових груп –SH і –S–S–, що спостерігаються у хворих з нестабільною стенокардією, гострим інфарктом міокарда без зубця Q та із зубцем Q, слід розглядати як значну складову у порушенні універсального неспецифічного механізму захисту організму хворих від ушкоджувальних чинників.

Наростання порушень функціонального стану груп –SH і –S–S– достовірно збільшується залежно від характеру структурно-функціональних пошкоджень міокарда відповідно до тяжкості клінічного перебігу захворювання: нестабільна стенокардія гострий інфаркт міокарда без зубця Q гострий інфаркт міокарда із зубцем Q, тому їх доцільно використовувати в кардіології як додаткові лабораторні тести для об’єктивізації остаточного діагнозу при загостренні ішемічної хвороби серця у період до 6 год від початку ангінозного нападу.

Література

1.Амосова Е.Н., Дыкун Я.В., Мишалов В.Г. Руководство по тромболитической терапии. – К., 1998. – 171 с.

2.Добровольский А.Б., Гусев Н.Б. Изучение реакционной способности сульфгидрильных групп тропонина // Биохимия. – 1976. – Т. 41, вып. 6. – С. 994-998.

3.Долженко М.Н. Европейские рекомендации по диагностике и лечению острого коронарного синдрома // Укр. мед. вісник Therapia. – 2006. – № 2 (02). – С. 5-12.

4.Запорожан В.Н., Бокал И.И., Костюшов В.В. Клиническое значение показателей тиол-дисульфидной системы при ВИЧ-инфекции // Журн. АМН Украины. – 2008. – Т. 14, № 4. – С. 175-187.

5.Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний: Учебное пособие. – Самара: "Самарский университет", 2006. – 216 с.

6.Костюшов В.В., Тымчишин О.Л., Кутковец С.Л. Влияние гликопротеинов антигена ВИЧ и морфина на сопутствующую реакцию высвобождения Ag+-чувствительных SH-содержащих небелковых соединений при взаимодействии "антиген-антитело" // Укр. біохіміч. журн. – 2002. – Т. 74, № 1. – С. 62-70.

7.Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона. I. Синтез, транспорт, глутатионтрансферазы, глютатионпероксидазы // Биомедицинская химия. – 2009. – Т. 55, Вып. 3. – С. 255–277.

8.Метелица В.И., Марцевич С.Ю., Кокурина Е.В. и др. Проблема толерантности к нитратам и пути ее решения у больных стенокардией // Кардиология. – 1993. – № 4. – С. 34-40.

9.Мешкова Н.П. Биохимия мышц.– М.: МГУ, 1979. – 128 с.

10.Паталах И.И., Урвант Л.П., Евстратова И.Н. и др. Белковые тиол-дисульфиды плазмы: роль в атерогенезе // Лабораторная диагностика. – 2008. – № 4 (46). – С. 11-15.

11.Соколовский В.В. Тиол-дисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма. – СПб.: МАПО, 1996. – 33 с.

12.Торчинский Ю.М. Сера в белках. – М.: Наука, 1977. – 303 с.

13.Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Червякова Н.В. Гомоцистеин. – М.: Реафарм, 2002. – 48 с.

14.Ashfaq S., Abramson J.L., Jones D.P. et al. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults // J. Amer. Coll. Cardiology. – 2006. – Vol. 47. – P. 1005-1012.

15.Durand P., Prost М., Loreau N. et al. Impaired homocysteine metabolism and atherothrombotic disease // Lab. Invest. – 2001. – Vol. 81, № 5. – P. 645-672.

16.Jones J.P., Go Y.M., Anderson C.L. et al. Cysteine/cystine couple is a newly recognized node in the circuitry for biologic redox signaling and control // FASEB J. – 2004. – Vol. 18, № 11. – P. 1246-1248.

Н.В. Костюшова.

Одеський державний медичний університет.

Укркардіо