Гіперреактивний тип імунної відповіді у хворих на стабільну стенокардію.

Запальна теорія атеросклерозу (АС) зараз як ніколи привертає увагу численних дослідників. Запальні процеси відіграють істотну роль як у формуванні атеросклеротичної бляшки (АБ), так і в ушкодженні стабільної атероми з подальшою тромботичною оклюзією й розвитком серцево-судинних ускладнень [3, 8]. Основним підходом при з'ясуванні можливої ролі запалення й аутоімунітету в атерогенезі є визначення природи антигенів і характеру клітинних взаємодій. Одним з основних напрямків досліджень є обговорення ролі імунокомпетентних клітин, факторів росту й хемоадгезивних молекул, медіаторів запалення, особливо прозапальних цитокінів [4].

Цитокіни посідають важливе місце серед великої кількості гуморальних медіаторів, що регулюють каскад біохімічних та імунологічних процесів і є основою запалення. Зміна їх рівня характеризує не тільки переважний напрямок імунної відповіді, яка визначається за активністю різних субпопуляцій Т-лімфоцитів-хелперів (Тh1- та Тh2-типів клітин), а й асоціюється з активністю та прогресуванням запалення. Такі прозапальні цитокіни, як інтерлейкін(ІЛ)-6, ІЛ-8 та фактор некрозу пухлин a (ФНП-a), що продукуються активованими Т-лімфоцитами та макрофагами, інфільтрацію яких спостерігають у місцях ушкодження стінки артерій, багато авторів вважають найбільш важливими факторами ризику розвитку гострого коронарного синдрому (ГКС), що беруть участь у дестабілізації та руйнуванні атеросклеротичної бляшки. Гіперреакцію імунної системи можна охарактеризувати завдяки визначенню здатності імунокомпетентних клітин синтезувати цитокіни, котрі беруть участь у запуску імунної відповіді, в розвитку запалення. Одним з основних цитокінів, що може лежати в основі розвитку ішемічної хвороби серця (ІХС), є ІЛ-6. Вважають, що ІЛ-6 є прозапальним цитокіном, який синтезується моноцитами/макрофагами, Т- і В-лімфоцитами, ендотелієм, підвищує активність цих клітин за аутокринним механізмом, сприяє проліферації В-клітин, підвищує синтез білків гострої фази запалення печінкою.

Мета роботи - дослідити зв'язок між вираженістю коронарного атеросклерозу та рівнем прозапальної імунної відповіді (гіперреактивний чи помірний тип) у хворих на стабільну стенокардію.

Матеріал і методи

Для визначення рівня запальної реакції імунної системи ми проаналізували результати імунологічних досліджень залежно від рівня секреції мононуклеарними клітинами (МНК) ІЛ-6 у 115 хворих з хронічною ІХС. Діагноз ІХС встановлювали за даними клінічних проявів захворювання, ЕКГ, результатами проб з дозованим фізичним навантаженням та даними коронарографії. У дослідження не включали хворих з гострими або хронічними запальними процесами, онкологічними та системними захворюваннями, хронічною серцевою недостатністю IIБ-III стадії, нирковою й печінковою недостатністю, бронхіальною астмою.

Селективну багатопроекційну коронарографію проводили за методом M.P. Judkins (1967) на ангіографічній установці "Angioscop-C" ("Siemens", Німеччина). При аналізі коронарограм враховували кількість уражених вінцевих судин, ступінь і локалізацію стенозів та розраховували сумарне ураження артерій серця (СУАС) за Ю.С. Петросян, Д.Г. Иоселиани (1976) та кількісне ураження коронарного русла за G.G. Gensini (1983).

Матеріалом імунологічного дослідження була периферійна кров, яку брали натщесерце. Визначали методом імуноферментного аналізу (ІФА) рівні ІЛ-6, ФНП-a) з використанням тест-систем ("ProCon", Росія), ІЛ-10, ІЛ-8, g-інтерферону (ІНФ) - з використанням тест-систем виробництва "Amersham" (США) та "Diaclone" (Франція) в супернатантах МНК (спонтанних та індукованих фітогемаглютиніном), які отримували після 24 год інкубації при температурі 37 °С; рівень С-реактивного білка (СРБ), розчинних молекул адгезії sICAM-1 та sVCAM-1 визначали в сироватці крові за допомогою імуноферментних тест-систем виробництва "Diagnostic Automation" (Канада) та "Immunotech" (Франція).

Рівень аутоантитіл до модифікованих ліпопротеїнів низької густини (ЛПНГ) визначали методом ІФА з використанням тест-систем "Biomedica Gruppe" (Австрія).

Визначали вміст загального холестерину (ХС), тригліцеридів (ТГ) та ХС ліпопротеїнів високої густини (ЛПВГ) плазми крові. Вміст ХС ліпопротеїнів дуже низької (ЛПДНГ) і низької (ЛПНГ) густини розраховували за формулою Friedewald. Розраховували індекс атерогенності та індекс перекисної модифікації атерогенних ліпопротеїнів. Визначали основні показники перекисного окиснення ліпідів (дієнові кон'югати (ДК), малоновий діальдегід (МДА), каталаза, супероксиддисмутаза (СОД)) та вільнорадикального окиснення білків (фенілгідразони).

У наших попередніх дослідженнях [1, 2] у хворих на стабільну стенокардію з різною вираженістю коронарного атеросклерозу було виявлено різний рівень імунного запалення та аутосенсибілізації (за високим рівнем аутоантитіл до модифікованих ЛПНГ - мЛПНГ) та дисліпідемії в цілому. Тому згідно з метою дослідження пацієнти були розподілені на дві групи. В 1-шу групу увійшли 34 пацієнти з незначним підвищенням рівня ІЛ-6 у МНК крові - 1028 (260-1240) пг/мл (Р>0,05 порівняно з контролем, в 1,2 разу більше), в 2-гу групу - 81 пацієнт з гіперсекрецією МНК ІЛ-6 - 3760 (2508-4874) пг/мл (відповідно Р=0,0001, в 4 рази більше).

Отримані дані обробляли методами варіаційної статистики за допомогою програм "Microsoft Eсxel" та "Statistica 5.5". Достовірність відмінностей розраховували за допомогою непараметричного критерію Манна-Уїтні (для незалежних виборок). Кореляційний аналіз проводили за допомогою непараметричного методу з розрахунком коефіцієнта кореляції Спірмена (R). Дані подані у вигляді медіани (Ме) і 0,25;0,75 персентилей (для ненормального розподілу даних).

Результати та їх обговорення

Вважають, що прозапальний цитокін ІЛ-6 відіграє ключову роль в індукції запальних реакцій. ІЛ-6 продукується лімфоцитами, моноцитами, фібробластами, адипоцитами й ендотеліальними клітинами. Він є основним цитокіном, що стимулює вироблення в гепатоцитах вторинних учасників запалення - білків гострої фази: СРБ, амілоїда А, гаптоглобіну, фібриногену, компонентів комплементу [6]. Зазначені фактори запускають каскад локальних і системних запальних реакцій. ІЛ-6 регулює активність інгібіторів матриксних металопротеїназ, тому від його рівня залежить вміст у коронарних ураженнях білків позаклітинного матриксу [5]. Підвищений вміст ІЛ-6 у стінках артерій асоціюється з прогресуванням атеросклерозу, ростом бляшок і їхньою трансформацією в ускладнені коронарні ураження [7].

Кореляційний аналіз показав прямий зв'язок між спонтанним та індукованим рівнем ІЛ-6 у МНК (R=0,57; р=0,0001). При оцінці клінічного стану хворих двох груп виявлено, що в 2-й групі порівняно з 1-ю за умови однакового віку пацієнтів - 57 (52-63) та 55 (49-63) років (р=0,43), однакової тривалості клінічних проявів ІХС - 4,5 (1,0-9,5) та 4,0 (1,0-9,5) року (р=0,73) і однакової частоти появи перших клінічних проявів ІХС до 45 років - 25 та 24 % (р=0,48) спостерігають достовірно більші показники сумарного ураження вінцевих артерій серця (за Ю.С. Петросян, Д.Г. Иоселиани) - 104 (58-153) та 55 (29-136) балів (р=0,05), кількісне ураження коронарного русла за G.G. Gensini - 61 (34-86) та 28 (11-50) балів (р=0,009), кількість уражених вінцевих судин - відповідно 2,0±0,9 та 2,3±0,8 (р=0,17). Виявлено кореляційний зв'язок між рівнем індукованого синтезу ІЛ-6 у МНК та кількісним ураженням коронарного русла за G.G. Gensini (R=0,60; р=0,019) та СУАС (R=0,49; р=0,05).

При аналізі ускладнень коронарного атеросклерозу групи не відрізнялися за частотою післяінфарктного кардіосклерозу - 47 та 43 % (р=0,52), хронічної серцевої недостатності - 4 та 10 % (р=0,33), показником фракції викиду лівого шлуночка (ЛШ) за даними ехокардіографії - 0,56 (0,50-0,62) та 0,54 (0,38-0,59) ум. од. (р=0,32). Виявлено зворотний кореляційний зв'язок між рівнем індукованого ІЛ-6 та фракцією викиду ЛШ (R=-0,68; р=0,016). Відзначали такі фактори ризику розвитку атеросклерозу в 2-й та 1-й групах: гіпертонічна хвороба - 76 та 72 % (Р=0,61), цукровий діабет - 12 та 4 % (Р=0,23), ожиріння - 64 та 42 % (Р=0,06), куріння - 7 та 30 % (Р=0,14), гіперхолестеринемія - 44 та 38 % (Р=0,55), гіпертригліцеридемія - 30 та 35 % (Р=0,35). Хворі обох груп не відрізнялися за наявністю супутніх захворювань - 15 та 27 % (Р=0,13) та особливостями лікування - 7 (7-10) та 7 (5-12) балів (Р=0,72). Таким чином, продукція прозапального ІЛ-6 у хворих на хронічні форми ІХС пов'язана з вираженістю коронарного атеросклерозу. Гіперпродукція ІЛ-6 прямо пов'язана зі ступенем стенозу та кількістю уражених вінцевих судин. Виявлено зворотний зв'язок між індукованим синтезом мононуклеарами ІЛ-6 та фракцією викиду ЛШ. Не виявлено чіткого зв'язку рівня експресії ІЛ-6 мононуклеарами крові з частотою розвитку післяінфарктного кардіосклерозу та факторами ризику атеросклерозу.

Ми оцінювали секрецію мононуклеарними клітинами інших прозапальних та протизапальних цитокінів.

Рівень спонтанного ФНП-a) в групі з гіперреактивним типом і з помірним підвищенням становив відповідно 414 (170-1491) та 78 (50-122) пг/мл (Р=0,0001); індукованого ФНП-a) - 248 (170-470) та 113 (68-231) пг/мл (P=0,015); спонтанного ІЛ-8 - 2440 (1250-3500) та 1800 (1060-2500) пг/мл (P=0,026), індукованого ІЛ-8 - 7600 (2800-8200) та 3665 (1600-5538) пг/мл (P=0,13); спонтанного g-ІНФ - 7,8 (2,9-15,0) та 5,0 (1,0-11,0) пг/мл (P=0,05), індукованого g-ІНФ - 602 (107-2107) та 16 (11-50) пг/мл (P=0,004); спонтанного ІЛ-10 - 780 (95-1360) та 18 (6-280) пг/мл (P=0,0004), індукованого ІЛ-10 - 955 (693-1475) та 62 (11-130) пг/мл (P=0,002). Рівень СРБ у 2-й та 1-й групі становив відповідно 5,4 (3,0-10,6) та 3,3 (1,8-6,7) мг/л (P=0,05). Кореляційний аналіз виявив зв'язок між рівнями синтезу ІЛ-6 та ФНП-a) (R=0,55; р=0,0001), ІЛ-8 (R=0,45; р=0,007), g-ІНФ (R=0,64; р=0,001), ІЛ-10 (R=0,40; р=0,001). Прямий кореляційний зв'язок між протизапальним ІЛ-10 та прозапальним ІЛ-6 підтверджує той факт, що рівень ІЛ-10 опосередковано характеризує вираженість імунного запалення. Таким чином, у 70 % хворих на стабільну стенокардію відзначають гіперактивацію імунокомпетентних клітин та значну секрецію прозапальних та протизапальних цитокінів, що супроводжується активацією системного імунного запалення.

Функціональна цілісність ендотелію забезпечує антиатерогенну й антитромботичну активність судинної стінки. Порушення функції ендотелію є одним з найважливіших незалежних факторів ризику атеросклерозу й тромбозу. Основними причинами порушення функції ендотелію при атеросклерозі вважають порушення не тільки локальної продукції NО, а також і генерації надлишкової кількості ендотелійзалежного супероксиду, що інактивує синтезовані молекули NО, стимулює окиснювання ЛПНГ і сприяє ушкодженню мембран ендотеліоцитів пероксинітритом і гідроксильними радикалами.

Аналіз функціонального стану ендотелію в умовах нормального та високого синтезу прозапального ІЛ-6 показав, що у хворих 2-ї групи суттєво підвищений рівень розчинних молекул адгезії (sICAM) - відповідно 643 (534-772) та 430 (400-674) нг/мл (Р=0,029), а також значно менший рівень VEGF - 136 (78-219) та 246 (140-337) пг/мл (р=0,04), що не сприяє неореваскуляризації судинної стінки. Кореляційний аналіз свідчить про прямий зв'язок між рівнями ІЛ-6 та sICAM (R=0,29; p=0,028) та зворотний - між рівнями ІЛ-6 та VEGF (R=-0,30; Р=0,017).

Рівень спонтанного ФНП-a) в групі з гіперреактивним типом і з помірним підвищенням становив відповідно 414 (170-1491) та 78 (50-122) пг/мл (Р=0,0001); індукованого ФНП-a) - 248 (170-470) та 113 (68-231) пг/мл (P=0,015); спонтанного ІЛ-8 - 2440 (1250-3500) та 1800 (1060-2500) пг/мл (P=0,026), індукованого ІЛ-8 - 7600 (2800-8200) та 3665 (1600-5538) пг/мл (P=0,13); спонтанного g-ІНФ - 7,8 (2,9-15,0) та 5,0 (1,0-11,0) пг/мл (P=0,05), індукованого g-ІНФ - 602 (107-2107) та 16 (11-50) пг/мл (P=0,004); спонтанного ІЛ-10 - 780 (95-1360) та 18 (6-280) пг/мл (P=0,0004), індукованого ІЛ-10 - 955 (693-1475) та 62 (11-130) пг/мл (P=0,002). Рівень СРБ у 2-й та 1-й групі становив відповідно 5,4 (3,0-10,6) та 3,3 (1,8-6,7) мг/л (P=0,05). Кореляційний аналіз виявив зв'язок між рівнями синтезу ІЛ-6 та ФНП-a) (R=0,55; р=0,0001), ІЛ-8 (R=0,45; р=0,007), g-ІНФ (R=0,64; р=0,001), ІЛ-10 (R=0,40; р=0,001). Прямий кореляційний зв'язок між протизапальним ІЛ-10 та прозапальним ІЛ-6 підтверджує той факт, що рівень ІЛ-10 опосередковано характеризує вираженість імунного запалення. Таким чином, у 70 % хворих на стабільну стенокардію відзначають гіперактивацію імунокомпетентних клітин та значну секрецію прозапальних та протизапальних цитокінів, що супроводжується активацією системного імунного запалення.

Функціональна цілісність ендотелію забезпечує антиатерогенну й антитромботичну активність судинної стінки. Порушення функції ендотелію є одним з найважливіших незалежних факторів ризику атеросклерозу й тромбозу. Основними причинами порушення функції ендотелію при атеросклерозі вважають порушення не тільки локальної продукції NО, а також і генерації надлишкової кількості ендотелійзалежного супероксиду, що інактивує синтезовані молекули NО, стимулює окиснювання ЛПНГ і сприяє ушкодженню мембран ендотеліоцитів пероксинітритом і гідроксильними радикалами.

Аналіз функціонального стану ендотелію в умовах нормального та високого синтезу прозапального ІЛ-6 показав, що у хворих 2-ї групи суттєво підвищений рівень розчинних молекул адгезії (sICAM) - відповідно 643 (534-772) та 430 (400-674) нг/мл (Р=0,029), а також значно менший рівень VEGF - 136 (78-219) та 246 (140-337) пг/мл (р=0,04), що не сприяє неореваскуляризації судинної стінки. Кореляційний аналіз свідчить про прямий зв'язок між рівнями ІЛ-6 та sICAM (R=0,29; p=0,028) та зворотний - між рівнями ІЛ-6 та VEGF (R=-0,30; Р=0,017).

Не було розбіжностей у групах між рівнями перекисної модифікації атерогенних ліпопротеїнів, хоча в обох групах вони були достовірно вищі, ніж у контролі: в групі з гіперреактивним та помірним типом імунної відповіді ступінь перекисної модифікації ліпопротеїнів становив відповідно 6,8 (4,5-9,2) та 6,2 (4,0-10,9) ум. од. (Р=0,84), вільнорадикальне окиснення білків - 4,8 (3,4-6,1) та 4,0 (2,9-5,7) ум. од. (Р=0,25), перекисне окиснення апобілків - 0,83 (0,55-1,38) та 0,71 (0,50-1,10) ум. од. (Р=0,47).

Показники перекисного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту у 2-й та 1-й групі відрізнялися від таких у контролі, але не відрізнялися між собою: МДА - відповідно 8,6 (6,2-12,2) та 9,4 (7,0-13,3) мкмоль/мл (Р=0,43), ДК - 2,7 (1,7-4,1) та 2,4 (1,3-4,1) ум. од. (Р=0,46), каталаза - 7,4 (6,3-9,9) та 7,3 (6,1-8,8) U/l (Р=0,46), СОД - 1942 (1316-3750) та 2094 (1121-2600) U/l (Р=0,90). Виявлено лише зв'язок між рівнем індукованої продукції мононуклеарами ІЛ-6 та МДА сироватки крові (R=0,37; р=0,03). Про однаково підвищений рівень модифікованих ліпопротеїнів в обох групах свідчила значна кількість аутоантитіл до мЛПНГ: 309 (48-570) та 232 (70-395) (Р=0,94). Але коефіцієнт кореляції між ІЛ-6 та антитілами до мЛПНГ становив 0,03 (р=0,77). Не виявлено чіткого зв'язку надмірного синтезу мононуклеарами крові прозапального ІЛ-6 з вираженістю порушення ліпідного обміну, перекисного окиснення ліпідів, кількістю мЛПНГ. Це свідчить про різний ступінь відповіді імунної системи на однаковий рівень антигенного ліпідного навантаження.

Висновки

У 70 % хворих на стабільну стенокардію відзначають гіперактивацію імунокомпетентних клітин та значну секрецію прозапальних цитокінів (фактор некрозу пухлин a, інтерлейкін-6 і -8, g-інтерферон), що супроводжується активацією системного імунного запалення у вигляді підвищення рівня С-реактивного білка.

Вираженість коронарного атеросклерозу (ступінь стенозу та кількість уражених вінцевих судин) прямо пов'язана з гіперреактивним типом запальної імунної відповіді у хворих на хронічні форми ішемічної хвороби серця. Не виявлено чіткого зв'язку рівня експресії прозапального інтерлейкіну-6 мононуклеарами крові з частотою післяінфарктного кардіосклерозу та факторами ризику розвитку атеросклерозу (артеріальна гіпертензія, цукровий діабет, куріння, ожиріння).

Гіперпродукція мононуклеарами крові прозапальних інтерлейкіну-6 і -8, фактора некрозу пухлин a, g-інтерферону поєднується з більшою активацією/дисфункцією ендотелію.

Не виявлено чіткого зв'язку гіперреактивного типу синтезу мононуклеарними клітинами інтерлейкіну-6 з вираженістю порушень ліпідного обміну та кількістю аутоантитіл до модифікованих ліпопротеїнів, що свідчить про різну вираженість прозапальної імунної відповіді на ліпідне антигенне навантаження у хворих на ішемічну хворобу серця.

Література

1.Гавриленко Т.І., Ломаковський О.М., Корніліна О.М. та ін. Імунореактивність у хворих на стабільну стенокардію в динаміці комплексного лікування із застосуванням симвастатину // Укр. кардіол. журн. - 2007. - № 2. - С. 54-59.

2.Лутай М.И., Гавриленко Т.И., Ломаковський О.М. та ін. Вираженість імунного запалення та клінічного стану хворих на стабільну стенокардію залежно від кількості CD40-клітин периферичної крові // Укр. кардіол. журн. - 2005. - № 4. - С. 34-37.

3.Мазуров В.И., Столов С.В., Линецкая Н.Э. Динамика уровней провоспалительных цитокинов у больных в зависимости от различных форм ИБС // Клин. мед. - 1999. - № 11. - С. 23-27.

4.Нагорнев В.А., Пигаревский П.В., Восканьянц А.Н. и др. Современные взгляды на патогенез атеросклероза с позиции инфекционной патологии // Вест. РАМН. - 2002. - № 10. - С. 9-15.

5.Ghiiravi A., Lipkowitz M., Diamond J. et al. Ambulatory blood pressure monitoring for delecting the relation between angiotensinogen gene polymorphism and hypertension // Amer. J. Hypenension. - 1997- Vol. 10. - P. 697-691.

6.Heinrich P., Castell J., Andus T. Interleukin-6 and die acute phase response // Biochem. J. - 1990. - Vol. 265. - P. 621-636.

7.Humphries S., Luong L., Ogg M. et al. The interleukin-6 - 174 G/C promoter polymorphism is associated with risk of coronary heart disease and systolic blood pressure in healthy men // Eur. Heart J. - 2001. - Vol. 22. - P. 2243-2252.

8.Libby P., Ridker P., Maseri A. Inflammation and atherosclerosis // Circulation. - 2002. - Vol. 105. - P. 1135-1147.

О.В. Волошина, О.М. Ломаковський, М.І. Лутай, Т.І. Гавриленко.

Національний науковий центр "Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска" АМН України, м. Київ.

Укркардіо