Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы у мужчин молодого возраста с различными уровнями артериального давления и наследственным анамнезом по артериальной гипертензии.

Показатели сосудистого ремоделирования используют в настоящее время для оценки кардиоваскулярного риска (КВР) при гипертонической болезни (ГБ) [1, 8]. И структурные, и функциональные изменения артерий при ГБ во многом обусловлены дисфункцией эндотелия (ДЭ). Установлено, что недостаток или ускоренный распад NO приводят к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ДЭ, повышением тонуса сосудов и артериального давления (АД) [2]. Описано несколько механизмов развития ДЭ. Один из них – конкурентное подавление и/или снижение активности эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [2, 7, 8, 12].

Генетическими факторами обусловлены 30–40 % случаев первичной артериальной гипертензии (АГ). Существует предположение, что и ДЭ может быть первичным, генетически детерминированным феноменом [7, 8]. ДЭ выявляют у нормотензивных родственников больных АГ, показана высокая ассоциативная связь ДЭ с развитием и прогрессированием ГБ [6–8]. При этом не всегда выявляют связь между степенью ДЭ и уровнем АД: нормализация АД не всегда сопровождается восстановлением эндотелийзависимой вазодилатации [7].

Развитие АГ обусловлено полиморфизмом многих генов [6, 8]. Полиморфизм генов, отвечающих за развитие АГ и поражение органов-мишеней, ассоциируется с ДЭ. Это полиморфные маркеры генов ангиотензинпревращающего фермента, рецептора ангиотензина II 1-го типа, eNOS и др. [6–8]. Значение гена eNOS в развитии АГ подтверждается тем, что у мышей с разрушенными генами eNOS отмечают более высокий уровень АД, чем у контрольных [7]. Ингибирование eNOS приводит к увеличению АД, как у людей, так и в эксперименте, а повышенная экспрессия гена eNOS вызывает развитие гипотензии. Введение гена eNOS улучшает функцию эндотелия и эндотелийзависимую вазодилатацию как in vitro, так in vivo [13]. Ген eNOS локализован в хромосоме 7q35-36. В экзонах и интронах гена eNOS обнаружено несколько полиморфных участков, среди которых наиболее значимыми являются два. Это минисателлитный повтор в интроне 4 (4a/b полиморфизм eNOS) и трансверсия G/T в позиции 894 нуклеотидной последовательности гена eNOS, что приводит к мутации в положении 298-белковой последовательности, ведущей к замене глутаминовой кислоты на аспарагиновую (Glu-Asp298) [2, 7, 12, 13]. Частота выявления аллелей 4а и 4b, а также распространенность мутации Glu-Asp298 варьирует в различных этнических группах. Имеются противоречивые данные о связи мутации Glu-Asp298 и 4a/b полиморфизма eNOS с развитием АГ [7, 8, 12, 13, 15]. Данных относительно частоты выявления аллелей гена eNOS и возможной их ассоциации с АГ и другими сердечно-сосудистыми заболеваниями в украинской популяции опубликовано мало, что и определило цель настоящей работы.

Цель исследования – оценка частоты распределения полиморфизма 4a/b и мутации Glu-Asp298 гена eNOS у молодых мужчин, украинцев, с различными уровнями артериального давления и наследственным анамнезом по артериальной гипертензии.

Материал и методы

Обследованы 89 мужчин, украинцев, проживающих в Одессе и Одесской области, не состоящих в родстве. Критерии включения в исследование: возраст 18–35 лет; нормальный, высокий нормальный уровень АД (ВНАД) и АГ 1-й степени (АГ1), установленные с соблюдением правил измерения офисного АД [2]; согласие на участие в исследовании. Критерии невключения: заболевания и состояния, приводящие к симптоматическому повышению АД; сопутствующие кардиоваскулярные, любые острые заболевания и известные вирусные инфекции на момент исследования. У всех пациентов определяли частоту сокращений сердца (ЧСС) в покое и оценивали факторы риска (ФР) (по уровню физической активности, диетическим привычкам – употреблению жирной пищи, поваренной соли, свежих фруктов и овощей, количества алкоголя в неделю; наличию курения; индексу массы тела (ИМТ); уровню холестерина и глюкозы натощак); проводили эхокардиографию с оценкой структурных параметров левого желудочка (ЛЖ) и размеров левого предсердия (ЛП) [3, 8, 10], оценивали относительный КВР [8].

Пациенты были разделены на четыре группы: 1-ю (контрольную) группу (n=25) составили пациенты с оптимально нормальным и нормальным АД [8] без наследственной отягощенности по АГ (НОАГ) и другим сердечно-сосудиcтым заболеваниям в двух поколениях семьи; 2-ю (n=26) – нормотензивные пациенты с НОАГ; 3-ю (n=18) – пациенты с ВНАД и АГ1 без НОАГ; 4-ю (n=20) – пациенты с ВНАД и АГ1 с НОАГ. Наследственный анамнез оценивали как положительный при наличии у пациента родственников первой степени родства, заболевших АГ в возрасте до 55 лет для мужчин и до 65 лет для женщин [11].

ДНК выделяли из клеток крови при помощи набора ДНК-сорб-В ("АмплиСенс", Россия) по инструкции производителя. Детекцию полиморфизма Glu-Asp298 в гене eNOS проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием протокола, приведенного в работе K. Hibi и соавторов [9]. Для амплификации участка гена eNOS, содержащего 7 экзон, использовали пару праймеров (ЗАО "Синтол", Россия): прямой – 5'-TCC CTG AGG AGG GCA TGA GGC T-3' и обратный – 5'-TGA GGG TCA CAC AGG TTC CT-3'. ПЦР проводили в объеме 20 мкл с добавлением 20–25 нг геномной ДНК, по 4 пмоль прямого и обратного праймера, 4 мкл 5xПЦР-буфера, MgSO4 в концентрации 1,5 ммоль/л, 1 единицы ДиаТак ДНК-полимеразы ("АмплиСенс", Россия), 200 мкмоль/л каждого дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфат), с использованием амплификатора "Primus" ("MWG-Biotech"). Процесс амплификации включал начальный этап денатурации ДНК при 95 °С продолжительностью 1,3 мин, 35 циклов амплификации (94 °С – 1 мин, 61 °С – 1 мин, 72 °С – 1 мин) и заключительный этап элонгации при 72 °С в течение 3 мин. После ПЦР 5 мкл реакционной смеси, содержавшей амплифицированный фрагмент длиной 457 пар нуклеотидов (пн) инкубировали при 37 °С в течение 16–20 ч с добавлением 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Eco24I (Fermentas) в буфере, рекомендованном производителем. В ходе рестрикции амплифицированные фрагменты расщепляли на более мелкие фрагменты длиной 137 пн и 320 пн. В случае замены G на Т в нуклеотидной позиции 1917 гена eNOS происходила потеря сайта рестрикции. Генотипирование полиморфизма 4a/b в гене eNOS: количество повторов (4 или 5) длиной 27 пн в 4 интроне гена eNOS определяли методом ПЦР при помощи пары праймеров, фланкирующих область повторов: прямой – 5'-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3' и обратный – 5'-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3' (ЗАО "Синтол", Россия) [15]. Амплификацию осуществляли в объеме 20 мкл с добавлением 20–25 нг геномной ДНК, по 4 пмоль прямого и обратного праймера, 4 мкл 5xПЦР-буфера, MgSO4 в концентрации 1,5 ммоль/л, 1 ед. ДиаТак ДНК-полимеразы ("АмплиСенс", Россия), 200 мкмоль/л каждого дНТФ, с использованием амплификатора "Primus" ("MWG-Biotech"). Процесс амплификации включал начальный этап денатурации ДНК при 95 °С продолжительностью 5 мин, 35 циклов амплификации (94 °С – 1 мин, 55 °С – 1 мин, 72 °С – 1 мин) и заключительный этап элонгации при 72 °С в течение 5 мин. Наличие продуктов амплификации в обоих случаях детектировали в 2 % агарозном геле, окрашенном бромидом этидия, с помощью системы видеодокументации "ImaGo" ("B&L Systems").

Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы "Excel'2003" [4]. Результаты приведены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (±SD). Для оценки различий между группами по количественным признакам при распределении, близком к нормальному, применяли t-критерий Стьюдента. Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использовали критерий c2. Достоверными считали различия при РЈ0,05; при 0,05

Результаты и их обсуждение

Все четыре группы пациентов были сопоставимы по возрасту, пациенты 1, 2-й и 3-й группы – по набору и частоте выявления ФР. У пациентов 4-й группы выявлено достоверно большее по сравнению с контролем число ФР. В 4-й группе было достоверно больше курильщиков и лиц с низкой физической активностью (гиподинамия) по сравнению со 2-й группой. Величины ИМТ у пациентов 4-й группы достоверно превышали значения у пациентов контрольной за счет большего числа лиц с избыточной массой тела. У больных 4-й группы ЧСС в покое была достоверно больше, чем в 1-й и 2-й группах. Эти данные подчеркивают роль факторов внешней среды в формировании гипертензивного фенотипа у лиц молодого возраста. Увеличение ЧСС у гипертензивных пациентов 4-й группы может отражать активацию симпатоадреналовой системы как раннего механизма повышения АД у лиц молодого возраста.

Частота выявления генотипов eNOS (полиморфизм 4a/b и мутация Glu-Asp298) и аллелей 4a, 4b, G/G и Т у пациентов 1-й и 2-й группы соответствовала таковым у здоровых людей в белой европейской популяции [2, 7, 13, 15]. Частота выявления аллеля 4a в гене eNOS достоверно не отличалась между группами. Но у больных 4-й группы с АГ частота аллеля 4а была большей, чем у лиц 2-й группы. То есть, во 2-й группе наличие НОАГ компенсируется снижением частоты аллеля 4а, а в 4-й группе сочетание НОАГ и большей частоты аллеля 4а приводит к повышению АД. Эти изменения могут отражать связь АГ и НОАГ с повышением частоты аллеля 4а. Частота аллеля 4b была наименьшей у пациентов с АГ и НОАГ (4-я группа). Не найдено различий в частоте встречаемости генотипов 4bb и 4аb между нормо- и гипертензивными пациентами. В других исследованиях не обнаружили достоверных различий частоты выявления аллелей 4а и 4b в группах пациентов с АГ и здоровых людей [7, 14].

Сравнение частоты выявления аллелей Glu-Asp298 G/G и Glu-Asp298 T в гене eNOS не выявило достоверных различий между группами. При этом среди гипертензивных лиц (3-я и 4-я группы) по сравнению с нормотензивными (1-я и 2-я группы) недостоверно уменьшалось число гомозигот G/G и отмечалась тенденция к увеличению числа гетерозигот Т/G. Имеются данные о связи мутации Glu-Asp298 Т с АГ. Ее частота выявления была выше у гипертензивных пациентов в японской популяции [14] и некоторых европейских популяциях [7].

В связи с малым числом наблюдений в группах пациентов с генотипами 4аа (n=4) и Glu-Asp298 ТТ (n=5) эти случаи были объединены соответственно с гетерозиготами 4ab и T/G и, таким образом, проводили анализ влияния присутствия аллеля 4а и мутации Glu-Asp298 T на клинические параметры. Среди носителей генотипов 4аа и 4ab по сравнению с носителями генотипа 4bb было выявлено большее число лиц с избыточной массой тела (соответственно 47,1 и 20,8 %, Р=0,042), больший уровень систолического АД (САД) – (127,2±8,3) мм рт. ст. (с генотипом 4bb – (123,0±9,9) мм рт. ст., Р=0,004) и тенденцию к увеличению диастолического АД (ДАД) (Р=0,064) за счет большего числа пациентов с ВНАД (сответственно17,8 и 38,7 %, Р=0,079). Сравнение частоты выявления НОАГ и степени выраженности КВР между носителями генотипа 4bb и 4(аа+ab) не выявило достоверных различий. У носителей генотипов 4аа и 4ab по сравнению с гомозиготами 4bb при эхокардиографии выявлены достоверно большие размеры ЛП, конечнодиастолический размер (КДР) и тенденция к меньшей относительной толщине стенок (ОТС) ЛЖ. Учитывая данные исследований о связи носительства аллеля 4a гена eNOS с развитием гипертрофии ЛЖ у больных с АГ [2, 7, 15], можно предположить, что в дальнейшем у этих пациентов будет формироваться эксцентрический тип ремоделирования ЛЖ.

Среди лиц с генотипами Glu-Asp298 Т и Т/G по сравнению с генотипом G/G выявлено большее число курильщиков (соответственно 50 и 23,1 %, Р=0,016), у этих пациентов был выше уровень САД (соответственно (126,8±10,1) и (122,2±7,7) мм рт. ст., Р=0,019), регистрировались различия в структурных параметрах ЛЖ – увеличение толщины задней стенки (ТЗС ЛЖ) (Р=0,029), тенденция к увеличению ОТС ЛЖ (Р=0,061) и больший индекс массы миокарда (ИММ ЛЖ) (Р=0,104). Результаты подтверждают данные, полученные в некоторых исследованиях [2, 7, 14, 15], об ассоциации гипертрофии ЛЖ при ГБ с носительством мутантного аллеля Т гена eNOS. Сравнение степени выраженности КВР между носителями генотипа Glu-Asp298 Т и Т/G не выявило достоверных различий.

Проведено сравнение частоты выявления комбинации полиморфизма 4а/b и мутации Glu-Asp298 eNOS у нормотензивных (n=51) и гипертензивных (n=38) пациентов в исследовании. Частота встречаемости комбинации полиморфизма 4а/b и мутации Glu-Asp298 eNOS у первых составила 9,8 %, у вторых – 22,6 % (Р=0,112). Наибольшая частота мультиаллельного полиморфизма выявлена у лиц с ВНАД и АГ1 и с НОАГ (4-я группа) – 30 %. Для сравнения в 1-й группе она составляла 16 % (Р1-4=0,262); во 2-й – 3,9 % (Р2-4=0,014); в 3-й – 9,1 % (Р3-4=0,183).

Выводы

У молодых мужчин с нормальным артериальным давлением, проживающих в Одесском регионе, частотные характеристики полиморфизма гена eNOS (полиморфизм 4a/b и мутации Glu-Asp298) соответствуют таковым у здоровых людей в белой европейской популяции.

Выявлены ассоциация полиморфизма 4a/b гена eNOS с наследственным анамнезом по артериальной гипертензии и структурными изменениями левого желудочка; а также увеличение частоты носительства аллеля 4а (генотипы 4аа и 4ab) у лиц с высоким нормальным артериальным давлением и артериальной гипертензией 1-й степени, с избыточной массой тела, курильщиков и лиц с гиподинамией.

У молодых мужчин Одесского региона присутствие мутации Glu-Asp298 гена eNOS не ассоциируется с наследственной предрасположенностью к артериальной гипертензии, но чаще отмечается у курильщиков, лиц с большими уровнями систолического артериального давления и влияет на структурные параметры левого желудочка.

Для мультиаллельного полиморфизма eNOS достоверные, не зависимые от наследственной предрасположенности к артериальной гипертензии, различия выявлены между нормо- и гипертензивными лицами.

Перспективными являются дальнейшие исследования прогностической и причинной роли полиморфных маркеров гена eNOS, а также их взаимодействия с другими генетическими и вешними факторами риска развития артериальной гипертензии.

Литература

1.Гундаров И.А., Полесски В.А., Власов В.В. Артериальная гипертензия – фактор риска или индикатор риска? // Медицина неотложных состояний. – 2007. – № 3(10). – С. 98-101.

2.Кравченко Н.А., Ярмыш Н.В. Биохимические и молекулярно-генетические механизмы регуляции синтеза оксида азота эндотелиальной NO-синтазой в норме и при сердечно-сосудистой патологии // Укр. терапевт. журн. – 2007. – № 1. – С. 82-89.

3.Купчинська О.Г., Свіщенко Є.П., Сіренко Ю.М. та ін. Сучасна діагностика та лікування гіпертрофії лівого шлуночка у хворих на артеріальну гіпертензію: Метод. рекомендації. – К., 2002. – 24 с.

4.Лапач С.Н., Губенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. – 2-е изд., перераб. и доп. – К.: Морион, 2001. – 408 с.

5.Минушкина Л.О. Генетические факторы в развитии эссенциальной гипертонии // Кардиология. – 2000. – № 3. – С. 69-75.

6.Свищенко Е.П., Коваленко В.Н. Гипертоническая болезнь. Вторичные гипертензии / Под ред. В.Н. Коваленко. – К.: Лыбидь, 2002. – 504 с.

7.Яковлева О.И., Вахрамеева И.В., Ларионова В.И. и др. Полиморфизм гена эндотелитальной NO-синтазы и структурно-функциональное состояние крупных сосудов у больных гипертонической болезнью с гипертрофией левого желудочка // Арт. гипертензия. – 2005. – Т.11. – № 3. – С. 195-200.

8.Brunner, Hanspeter, Cockcroft еt al. Endothelial function and dysfunction. Part II: Association with cardiovascular risk factors and diseases. A statement by the Working Group on Endothelins and Endothelial Factors of the European Society of Hypertension // J. Hypertension. – 2005. – Vol. 23(2). – P. 233-246.

9.Hibi K., Ishigami T., Tamura K. et al. Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphism and Acute Myocardial Infarction // Hypertension. – 1998. – Vol. 32. – P. 521-526.

10.Left ventricular hypertrophy / Ed. D.J. Sheridan. – Churchill Livingstone, 1998. – 209 p.

11.Mancia G., de Backer G., Dominiczak A. et al. 2007 Guidelines for the Management of Arterial Hypertension The Task Force for the Management of Arterial Hypertension of the European Society of Hypertension (ESH) and of the European Society of Cardiology (ESC) // J. Hypertension. – 2007. – Vol. 25. – P. 1105-1187.

12.Rossi G.P., Taddei S., Virdis A. et al. The T-786C and Glu298Asp polymorphisms of the endothelial nitric oxide gene affect the forearm blood flow responses of Caucasian hypertensive patients // J. Amer. Coll. Cardiology. – 2003. – Vol. 41. – P. 938-945.

13.Tuomo R., Treva R., Louis Pe’russe et al. NOS3 Glu298Asp Genotype and blood pressure response to endurance training. The HERITAGE Family Study // Hypertension. – 2000. – Vol. 36. – P. 885-889.

14.Wang X.L., Sim A.S., Badenhop R.F. et al. A smoking-dependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene // Nat. Med. – 1996. – Vol. 2. – P. 41-45.

15.Williams S.M., Addy J.H., Phillips III J.A. et al. Combinations of variations in multiple genes are associated with hypertension // Hypertension. – 2000. – Vol. 36. – P. 2-6.

С.А. Тихонова, К.В. Литовкин.

Одесский государственный медицинский университет.

Укркардіо