Діагностичне значення сульфгідрильних і дисульфідних груп у хворих з гострим коронарним синдромом.

Науковий інтерес щодо дослідження сульфгідрильних (-SH) і дисульфідних (-S-S-) груп у кардіології, перш за все, пов’язаний з їх значенням у структурно-функціональній організації білків, низькомолекулярних тіолів, а також у регуляції окиснювально-відновної рівноваги і метаболічних процесів [7, 11, 12, 16]. На наш погляд, суттєвим для вдосконалення діагностичних стандартів у кардіології є дані літератури про наявність груп -SH в активному центрі креатинфосфокінази (КФК) і її МВ-фракції (КФК-МВ) [5], у структурно-функціональній організації тропоніну [2], міоглобіну [9] та низькомолекулярних тіолів: гомоцистеїну, цистеїну і глутатіону [7, 11, 12, 16]. На сьогодні визначення цих білкових і низькомолекулярних сполук вважається найбільш інформативним у разі ішемічної хвороби серця (ІХС) [1, 5, 13]. Активно вивчають причинний зв’язок порушення метаболізму тіолових сполук з розвитком атеротромбозу [10, 13-15], але поки ще чітко не визначена функціональна роль у цих порушеннях груп -SH і -S-S- та їх діагностичне значення у хворих з гострим коронарним синдромом (ГКС).

Мета роботи - з’ясувати особливості функціонального стану білкових і небілкових груп -SH і -S-S- і обґрунтувати їх діагностичне значення за різних клінічних форм гострого коронарного синдрому.

Матеріал і методи

В обстеження залучено 102 пацієнти (чоловіків - 86; жінок - 16) віком від 28 до 65 років з ГКС, що перебували на стаціонарному лікуванні у відділенні кардіореанімації Військово-медичного клінічного центру Південного регіону (м. Одеса). Всіх хворих обстежували у період до 6 год від початку ангінозного нападу. Остаточний діагноз встановлювали на підставі даних клінічного, електрокардіографічного і біохімічного (рівні КФК-МВ, кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну) досліджень [1, 5], що відповідало Європейським рекомендаціям з діагностики і лікування ГКС [3]. В результаті ретроспективного аналізу даних хворих розподілили на три групи з остаточно сформованим клінічним діагнозом. Перша група - 49 пацієнтів з нестабільною стенокардією (НС), визначеною на підставі клінічних симптомів, а також ознак транзиторної депресії сегмента SТ і змін зубця Т не менше ніж у двох відведеннях на ЕКГ. При цьому, показники активності КФК-МВ, вмісту кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну вкладалися в межі референтних значень. Друга група - 27 пацієнтів, у яких розвинувся гострий інфаркт міокарда (ГІМ) без зубця Q. Поряд із клінічними симптомами у цих хворих найчастіше виявляли більш стійку депресію сегмента SТ, порушення морфології зубця Т і відсутність зубця Q на ЕКГ. При цьому мали місце типове підвищення активності КФК-МВ, рівня кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну, які перевищували референтні значення відповідно у 3,9; 4,4 і 80 разів. Третя група - 26 пацієнтів, у яких розвинувся ГІМ із зубцем Q. Про це свідчили клінічні симптоми, ознаки ішемії міокарда на ЕКГ (нова елевація сегмента SТ у точці J принаймні на 0,2 мВ у відведеннях V1-VЗ і на 0,1 мВ в інших відведеннях, зміна зубця Т), а також ознаки некрозу міокарда, зокрема конфігурації комплексу QRS. Клінічно сформований інфаркт міокарда у цих пацієнтів характеризувався появою зубця Q у будь-якому відведенні від V1 до V3, або зубця Q тривалістю 0,03 с у відведеннях І, II, аVL, аVF, V4, V5 або V6. У цих хворих мало місце типове підвищення активності КФК-МВ, рівня кардіоспецифічного тропоніну I і міоглобіну. Кратність їх підвищення була відповідно у 4,8; 6,8 і 157 разів.

У дослідження включено лише тих хворих з ГКС, у яких клінічний наслідок захворювання був сприятливий. На догоспітальному етапі практично всі пацієнти отримували: валідол, нітрати, ненаркотичні і/або наркотичні аналгетики, гепарин, сибазон, ацетилсаліцилову кислоту тощо.

Для з’ясування референтних значень показників, що вивчаються, обстежено контрольну групу - 100 практично здорових добровольців і донорів крові (чоловіків - 92 і жінок - 8) віком 20-65 років, без клінічних, електрокардіографічних і лабораторних ознак ІХС.

Дослідження активності ферменту КФК-МВ проведено на автоматичному біохімічному аналізаторі Cobas Mira Plus (Швейцарія) з використанням наборів реактивів фірми Lachema (Чехія). Вміст кардіоспецифічного тропоніну I вивчено методом імуноферментного аналізу з використанням тест-систем Biomerica Inc. (США) і Sanofi Diagnostics Pasteur (Франція). Вимірювання оптичної щільності зразків при довжині хвилі 450 нм здійснювали на багатоканальному вертикальному фотометрі Sanraise виробництва Tecan (Австрія) і LP 400 виробництва Sanofi Diagnostics Pasteur (Франція). Вміст міоглобіну визначали у реакції прямої гемаглютинації з використанням еритроцитарного діагностикуму ("ДС-эритромиоглобин", Росія).

Вміст білкових і небілкових груп -SH визначали в сироватці крові методом зворотного амперметричного титрування [11] в модифікації [6]. Аналогічним методом визначали вміст груп -S-S- після попереднього розщеплення дисульфідних зв’язків насиченим розчином сульфіту натрію. Небілкову фракцію сироваток крові отримували шляхом їх депротеїнізації розчином метафосфорної кислоти (10 %) [6]. За відношенням відновлених (-SH) і окиснених (-S-S-) функціональних груп розраховували білковий і небілковий тіол-дисульфідний коефіцієнти (SH/SS), значення яких відображають окиснювально-відновну рівновагу у тіол-дисульфідній системі: R-SH R-S-S-R [11, 13, 14].

Статистичну обробку даних проводили за порівнянням вибіркових середніх величин (M±m), з використанням t-критерію Стьюдента. За рівень статистичної значущості приймали Р<0,05.

Результати та їх обговорення

Виявлено, що в сироватці крові осіб контрольної групи кількість білкових груп -SH і -S-S- переважала над вмістом небілкових груп -SH і -S-S-. При цьому, функціональна активність білкових груп -SH була вищою, ніж білкових груп -S-S-, а небілкових груп -SH - нижчою, ніж небілкових груп -S-S-, тому показники білкового і небілкового SH/SS коефіцієнтів були відповідно > 1 і < 1.

У всіх хворих у період до 6 год від початку ангінозного нападу встановлено однакову спрямованість порушення вмісту білкових і небілкових груп -SH і -S-S-. Вона полягала у достовірному зниженні вмісту білкових груп -SH та підвищенні рівня білкових груп -S-S- і, навпаки, в підвищенні вмісту небілкових груп -SH та зниженні рівня небілкових груп -S-S- у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та із зубцем Q порівняно з аналогічними показниками осіб контрольної групи. Необхідно зазначити особливості порушення співвідношення між вмістом груп -SH і -S-S- у сироватці крові хворих, про що свідчили показники білкового і небілкового коефіцієнтів SH/SS. Так, встановлено, що у хворих на НС та пацієнтів з ГІМ без зубця Q, як і в осіб контрольної групи, показник білкового коефіцієнта SH/SS був > 1, що обумовлено переважанням вмісту білкових груп -SH над рівнем білкових -S-S-. Проте, як у хворих на НС, так і у хворих на ГІМ без зубця Q білковий коефіцієнт SH/SS був вірогідно нижчим, ніж у осіб контрольної групи. У хворих на НС і з ГІМ без зубця Q, як і в осіб контрольної групи, показник небілкового коефіцієнта SH/SS, навпаки, був < 1. Це означає, що вміст небілкових груп -S-S- преважає над рівнем небілкових груп -SH. Поруч з цим як у хворих на НС, так і у хворих на ГІМ без зубця Q небілковий коефіцієнт SH/SS був вірогідно вищим, ніж у осіб контрольної групи. На відміну від хворих на НС і пацієнтів з ГІМ без зубця Q, у всіх хворих з ГІМ із зубцем Q спостерігали "інверсію" білкового і небілкового коефіцієнтів SH/SS, тобто докорінну зміну порядку співвідношення між вмістом груп -SH і -S-S- на зворотний. Це було пов’язано із занадто різким зниженням вмісту білкових груп -SH і підвищенням рівня білкових груп -S-S-, і навпаки, занадто різким підвищенням рівня небілкових груп -SH і зниженням вмісту небілкових груп -S-S-. Тому білковий і небілковий коефіцієнти SH/SS у хворих на ГІМ із зубцем Q були відповідно < 1 і > 1. Встановлено також, що наростання порушень функціонального стану груп -SH і -S-S- вірогідно збільшується залежно від характеру структурно-функціональних пошкоджень міокарда відповідно до тяжкості клінічного перебігу захворювання: НС ГІМ без зубця Q ГІМ із зубцем Q у період до 6 год від початку ангінозного нападу.

Обговорюючи результати, перш за все, необхідно зупинитися на даних, отриманих при обстеженні осіб контрольної групи. Закономірності функціонування білкових і небілкових груп -SH і -S-S- можна пояснити структурними властивостями атома сірки в білках і низькомолекулярних тіолах, наведеними в роботах [10-12]. Завдяки цим властивостям, групи -SH залишків цистеїну у білках відрізняються найбільш високою здатністю до реакції і різноманітністю хімічних перетворень, а реакції, в які вступають групи -S-S- цистеїну в білках, не такі різноманітні, як реакції груп -SH. Стійкість зв’язків -S-S- до різних взаємодій за фізіологічних значень рН і температури добре відповідає їх основній функції - участі в стабілізації макромолекулярної структури білків [12]. Тому групи -SH роблять значний внесок у здатність білків до реакції, а групи -S-S- - у стабілізацію структури білкових молекул, а отже, і в реалізацію їх біологічних функцій. Описаними вище процесами пояснюється переважання рівня білкових груп -SH над вмістом білкових груп -S-S- у сироватці крові осіб контрольної групи.

Закономірності функціонування небілкових груп -SH і -S-S- в контрольній групі можна пояснити структурними властивостями низькомолекулярних тіолів (глутатіону, цистеїну, гомоцистеїну та ін.). У природі вони існують у двох формах - відновній (R-SH) і окисненій (R-S-S-R) і переважають не в плазмі крові, а у всіх клітинах, де відбувається ферментативне відновлення дисульфідів [7]. За фізіологічних умов проникність клітинних мембран для низькомолекулярних тіолів незначна, однак їх "міграція" в периферичну кров все ж таки відбувається. У плазмі крові ферментативне відновлення дисульфідів практично не відбувається, тому в ній лише 1 % тіолів низької молекулярної маси існує у вигляді відновної (R-SH) форми, близько 70 % утворюють змішані дисульфідні зв’язки з білками (R-S-S-Р), особливо з альбуміном, і майже 30 % - це дисульфіди низької молекулярної маси (R-S-S-R) [13]. Причому утворення змішаних дисульфідних зв’язків забезпечує можливість енергетично вигідної підтримки гомеостазу антиоксидантів, що містять ці функціональні групи, без активації їх біосинтезу [7]. Процесами, описаними вище, пояснюється переважання рівня небілкових груп -S-S- над вмістом небілкових -SH у сироватці крові осіб контрольної групи. У цілому, результати, отримані в контрольній групі, свідчать про збалансоване функціонування білкових і небілкових груп -SH і -S-S-, що обумовлено стабільним структурно-функціональним станом білків (ферментів) і низькомолекулярних тіолів, а також фізіологічним рівнем їх міграції з клітин у периферичну кров. Значення цих показників в осіб контрольної групи практично збігаються з даними інших авторів [4, 6], тому їх прийнято за референтні.

Особливості функціонування білкових і небілкових -SH і -S-S- груп у хворих можна пояснити таким чином. Згідно з даними літератури [10-12], порушення вмісту білкових груп -SH і -S-S- може опосередковуватися конформаційними перебудовами білків, зміною їх іонного оточення і гідрофобними взаємодіями. На наш погляд, конформаційні перебудови білків обумовлені їх окиснювальною модифікацією, про що свідчать зниження вмісту білкових груп -SH і підвищення кількості білкових груп -S-S- у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та з ГІМ із зубцем Q, а також зниження білкового коефіцієнта SH/SS у хворих на НС, ГІМ без зубця Q та "інверсія" білкового коефіцієнта SH/SS у хворих з ГІМ із зубцем Q.

Підвищення вмісту небілкових груп -SH і зниження кількості небілкових груп -S-S- у сироватці крові хворих можна пояснити: по-перше, порушенням у клітинах (у тому числі ендотелію і міокарда) метаболізму низькомолекулярних тіолів, які містять ці функціональні групи [13-15], підвищеною "міграцією" їх з пошкоджених клітин у периферичну кров [7] та затримкою виведення з організму [13]: по-друге, конформаційними перебудовами білкових молекул, що супроводжуються відновленням змішаних дисульфідних зв’язків з білками (R-S-S-Р), а також відновленням дисульфідів низької молекулярної маси (R-S-S-R) [7, 11, 16]. На це вказують підвищення вмісту небілкових -SH і зниження кількості небілкових груп -S-S- у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та з ГІМ із зубцем Q, а також підвищення небілкового коефіцієнта SH/SS у хворих на НС, з ГІМ без зубця Q та "інверсія" небілкового коефіцієнта SH/SS - у хворих на ГІМ із зубцем Q.

Розбалансування окиснювально-відновних R-SHR-S-S-R перетворень у білках і низькомолекулярних тіолах взагалі може бути обумовлено їх імунним ушкодженням [6]. Ці процеси пов’язані з ерозією і розривом атеросклеротичної бляшки, тромбозом вінцевих артерій і мікроемболією, а також коронарною вазоконстрикцією і інфарктом міокарда, які є спільною патофізіологічною основою загострення ІХС [1]. Тому за динамікою зміни вмісту білкових і небілкових груп -SH і -S-S- можна своєчасно зафіксувати наростання активності системи зсідання і пригнічення системи фібринолізу у хворих. Таке припущення підтверджують наші дослідження, згідно з якими наростання порушень функціонального стану білкових і небілкових груп -SH і -S-S- вірогідно збільшувалося залежно від характеру пошкодження міокарда у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та ГІМ із зубцем Q. Крім того, в літературі наведено важливу роль систем зсідання-фібринолізу у формуванні пулу плазмових і сироваткових білків, які містять групи -SH залишків цистеїну і групи -S-S- цистеїну [10]. З порушенням метаболізму гомоцистеїну і цистеїну пов’язують формування оксидативного, метаболічного, судинно-тромбоцитарного і коагуляційного компонентів атеротромбозу [13-15]. Встановлено також, що у хворих на стенокардію порушення властивості органічних нітратів зв’язуватися з групами -SH відіграє важливу роль у розвитку толерантності до нітратів [8].

На нашу думку, до неспецифічних факторів, які суттєво впливають на активність ферменту КФК-МВ, рівень міоглобіну і кардіоспецифічного тропоніну I, гомоцистеїну і цистеїну, які в основному порушені у хворих на ГІМ із зубцем Q та без зубця Q [1, 13, 15], можна віднести розбалансування окиснювально-відновних перетворень R-SHR-S-S-R у цих сполуках. Це підтверджують дослідження авторів [6, 7, 10-12, 14, 16], згідно з якими у інактивації і реактивації білків (ферментів), антитіл тощо відіграє важливу роль окиснювально-відновний стан сироватки крові, який значною мірою залежить від співвідношення між вмістом груп -SH і -S-S- у білках і низькомолекулярних сполуках. З урахуванням одержаних результатів, автор не виключає, що застосування інших реагентів та методів для визначення груп -SH і -S-S- [11, 12] може сприяти більш поглибленому вивченню їх ролі в розвитку метаболічних порушень за умов загострення ІХС та вдосконалення методів діагностики і лікування.

Зупинимося на доцільності використання показників функціонального стану груп -SH і -S-S- та їх діагностичної інформативності у хворих із серцево-судинними захворюваннями. На сьогодні вважається аксіомою, що найбільш інформативними біохімічними тестами виявлення некрозу міоцитів є підвищення активності ферменту КФК-МВ, вмісту міоглобіну і тропонінів у плазмі крові, природно за наявності клінічних ознак ішемії [1]. Проте для розв’язання численних проблем, що стоять перед практичною кардіологією, завжди необхідне поєднання різних за принципом, чутливістю, швидкістю і способами реєстрації методів. У цьому аспекті метод амперметричного титрування дозволяє проводити комплексну оцінку показників функціонального стану груп -SH і -S-S-, причому тривалість дослідження і отримання результатів становлять близько 1-2 хв [11, 12]. Це набуває особливої значущості, враховуючи важливість чинника часу в діагностиці і обґрунтуванні терапії при ГКС. Між тим, ці показники доцільно використовувати лише як додаткові клініко-лабораторні тести для об’єктивізації діагнозу, а клінічна інтерпретація їх обов’язково повинна проводитися в контексті інших диференціальних діагнозів. Хоча ішемія вінцевих артерій супроводжується описаними вище особливостями функціонального стану груп -SH і -S-S-, проте, згідно з даними літератури [11], вона є лише однією з безлічі причин зміни їх вмісту. Незалежно від цього, наростання порушень показників вказує на менш сприятливий прогноз, ніж якби вони були в нормі. Тому, коли немає клінічних даних, які дають можливість припустити наявність ішемії вінцевих артерій, необхідно проводити пошук інших причин. У зв’язку з цим інтерпретація порушень функціонального стану груп -SH і -S-S- у хворих із серцево-судинними захворюваннями повинна обов’язково здійснюватися із урахуванням загальної клінічної картини.

Крім того, накопичені експериментальні та клінічні дані [2, 3, 6, 10, 11, 13, 14], які свідчать, що вплив на організм екстремальних чинників призводить до однотипних, хоча і кількісно відмінних, змін вмісту тіол-дисульфідних груп, у тому числі при ГКС. Тому розлади вмісту і співвідношення білкових та небілкових груп -SH і -S-S-, що спостерігають у хворих на НС, пацієнтів з ГІМ без зубця Q та з ГІМ із зубцем Q, слід розглядати як можливі складові у порушенні універсального неспецифічного механізму захисту організму хворих до ушкоджувальних чинників.

Висновки

У хворих на нестабільну стенокардію, гострий інфаркт міокарда без зубця Q та із зубцем Q у період до 6 год від початку ангінозного нападу встановлено вірогідне зниження вмісту білкових груп -SH та підвищення рівня білкових груп -S-S- і, навпаки, підвищення вмісту небілкових груп -SH та зниження рівня небілкових груп -S-S- порівняно з аналогічними показниками осіб контрольної групи.

Зниження білкового і підвищення небілкового коефіцієнтів SH/SS при загостренні ішемічної хвороби серця пов’язано з порушенням співвідношення між вмістом груп -SH і -S-S-, як у білках, так і низькомолекулярних тіолах, що побічно свідчить про конформаційні перебудови цих сполук і підвищену міграцію їх з пошкоджених клітин у периферичну кров.

Розлади тіол-залежного окиснення, вмісту і співідношення білкових та небілкових груп -SH і -S-S-, що спостерігаються у хворих з нестабільною стенокардією, гострим інфарктом міокарда без зубця Q та із зубцем Q, слід розглядати як значну складову у порушенні універсального неспецифічного механізму захисту організму хворих від ушкоджувальних чинників.

Наростання порушень функціонального стану груп -SH і -S-S- достовірно збільшується залежно від характеру структурно-функціональних пошкоджень міокарда відповідно до тяжкості клінічного перебігу захворювання: нестабільна стенокардія гострий інфаркт міокарда без зубця Q гострий інфаркт міокарда із зубцем Q, тому їх доцільно використовувати в кардіології як додаткові лабораторні тести для об’єктивізації остаточного діагнозу при загостренні ішемічної хвороби серця у період до 6 год від початку ангінозного нападу.

Література

1.Амосова Е.Н., Дыкун Я.В., Мишалов В.Г. Руководство по тромболитической терапии. - К., 1998. - 171 с.

2.Добровольский А.Б., Гусев Н.Б. Изучение реакционной способности сульфгидрильных групп тропонина // Биохимия. - 1976. - Т. 41, вып. 6. - С. 994-998.

3.Долженко М.Н. Европейские рекомендации по диагностике и лечению острого коронарного синдрома // Укр. мед. вісник Therapia. - 2006. - № 2 (02). - С. 5-12.

4.Запорожан В.Н., Бокал И.И., Костюшов В.В. Клиническое значение показателей тиол-дисульфидной системы при ВИЧ-инфекции // Журн. АМН Украины. - 2008. - Т. 14, № 4. - С. 175-187.

5.Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний: Учебное пособие. - Самара: "Самарский университет", 2006. - 216 с.

6.Костюшов В.В., Тымчишин О.Л., Кутковец С.Л. Влияние гликопротеинов антигена ВИЧ и морфина на сопутствующую реакцию высвобождения Ag+-чувствительных SH-содержащих небелковых соединений при взаимодействии "антиген-антитело" // Укр. біохіміч. журн. - 2002. - Т. 74, № 1. - С. 62-70.

7.Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона. I. Синтез, транспорт, глутатионтрансферазы, глютатионпероксидазы // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55, Вып. 3. - С. 255-277.

8.Метелица В.И., Марцевич С.Ю., Кокурина Е.В. и др. Проблема толерантности к нитратам и пути ее решения у больных стенокардией // Кардиология. - 1993. - № 4. - С. 34-40.

9.Мешкова Н.П. Биохимия мышц.- М.: МГУ, 1979. - 128 с.

10.Паталах И.И., Урвант Л.П., Евстратова И.Н. и др. Белковые тиол-дисульфиды плазмы: роль в атерогенезе // Лабораторная диагностика. - 2008. - № 4 (46). - С. 11-15.

11.Соколовский В.В. Тиол-дисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма. - СПб.: МАПО, 1996. - 33 с.

12.Торчинский Ю.М. Сера в белках. - М.: Наука, 1977. - 303 с.

13.Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Червякова Н.В. Гомоцистеин. - М.: Реафарм, 2002. - 48 с.

14.Ashfaq S., Abramson J.L., Jones D.P. et al. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults // J. Amer. Coll. Cardiology. - 2006. - Vol. 47. - P. 1005-1012.

15.Durand P., Prost М., Loreau N. et al. Impaired homocysteine metabolism and atherothrombotic disease // Lab. Invest. - 2001. - Vol. 81, № 5. - P. 645-672.

16.Jones J.P., Go Y.M., Anderson C.L. et al. Cysteine/cystine couple is a newly recognized node in the circuitry for biologic redox signaling and control // FASEB J. - 2004. - Vol. 18, № 11. - P. 1246-1248.

Н.В. Костюшова.

Одеський державний медичний університет.

Украинский кардиологический журнал