Анализы на туберкулез

Мокроты больного — это смесь секрета желез слизистой оболочки трахеи и бронхов, серозного выпота из патологически измененных сосудов, иногда частиц казеозных масс, некротической грануляционной и легочной ткани, а также примеси солей. Мокроты выделяется при многих заболеваниях легких и бронхов.

В туберкулезных учреждениях больные собирают мокроту в индивидуальные контейнеры, на четверть емкости заполнены раствором хлорамина, где оно частично дезинфицируется. Контейнеры градуированные, и это дает возможность определять суточное количество мокроты.

• Бактериоскопический метод
• Метод флотации
• Люминесцентная микроскопия
• Фазово-контрастная микроскопия
• Исследование смыва из бронхов
• Исследование мочи, кала, цереброспинальной и плевральной жидкости на МБТ
• Биологический метод
• Ускоренные методы поиска микобактерий
• Молекулярно-генетические методы

Макроскопически у больных туберкулезом легких мокрота имеет слизистый или слизисто-гнойный характер, без запаха, гомогенная, не образует слоев. Количество мокроты может быть разной. В начале заболевания туберкулезом легких мокрота не выделяется, затем оно может выделяться утром отдельными плевками, позже его количество может достигать 100-200 мл.

После макроскопического проводят бактериоскопическое, бактериологическое и биологическое исследование мокроты.

Бактериоскопический метод

Бактериоскопический метод охватывает прямую бактериоскопию мазков из патологического материала, окрашенных по Цилю-Нильсену, бактериоскопию методом флотации, люминесцентную микроскопию, фазовоконтрастного микроскопию.

Бактериоскопическое исследование мокроты начинается с приготовления мазка. Для этого мокроты смешивают с раствором натрия гидроксида и центрифугируют для получения осадка. Осадок стеклянными палочками переносят на предметное стекло. Вторым предметным стеклом его равномерно размещают: накрывают покровным стеклом. Препарат изучают под микроскопом. В нем можно увидит лейкоциты, эластичные волокна, а при специальной окраске — атипичные клетки и различные бактерии.

Микобактерии окрашиваются по Граму положительно. Для выявления МБТ готовят мазок мокроты высушивают его, фиксируют над пламенем спиртовки, после чего окрашивают по Цилю-Нильсену. Окраска производится сначала карболовым раствором фуксина. Микобактерии туберкулеза плохо воспринимают окраску, поэтому раствор фуксина наносят на препарат в большом количестве, подогревают над пламенем спиртовки до появления пара. Затем краску сливают, препарат промывают в воде и обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты или в смеси этилового спирта с раствором соляной кислоты. При этом все бактерии и морфологические элементы мокроты, кроме микобактерий туберкулеза, бесцветные. Мазок промывают проточной водой, а затем наносят метиленовый синий на 1-2 мин. После этого раствор краски сливают, мазок промывают и высушивают. Препарат изучают через иммерсионной систему микроскопа, для чего на препарат наносят каплю иммерсионного масла, чтоб создать одинаковую среду между линзой объектива и препаратом. Микобактерии туберкулеза под микроскопом видно окрашенными в красный цвет.

Метод окраски по Цилю-Нильсену позволяет выявить микобактерии туберкулеза в тех случаях, когда в 1см3 мокроты содержится около 5000 - 10000 МБТ при условии, если просмотрено 300 полей зрения. При небольшом количестве МБТ в мокроте бактериоскопический метод неэффективен.

Исследование мокроты следует проводить в течение трех дней подряд, а при отрицательном результате — применить метод флотации.

Метод флотации

Он основан на том, что при встряхивании двух жидкостей с различным удельным весом легче жидкость всплывает на поверхность одновременно с микобактериями туберкулеза, находящихся в суспензии. Суть методики заключается в том, что готовят водную суспензию с углеводородами (ксилол, бензол) и МБТ. На поверхность воды утечет сливкообразная пена с МБТ, которую отсасывают пипеткой и наносят на предметное стекло. Слой пены на предметном стекле высушивают и наносят новый слой пены из колбы. Так наслаивают пену 5-6 раз, после чего мазок фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Люминесцентная микроскопия

Эффективным методом выявления микобактерий туберкулеза является люминесцентная микроскопия. Суть метода заключается в способности микобактерий туберкулеза, окрашенные специальными красителями (аурамин, родамин), светиться при облучении ультрафиолетовыми лучами. Преимуществом метода люминесцентной микроскопии является возможность проведения исследований при меньших увеличениях микроскопа, обеспечивает просмотр в короткий срок большего количества полей зрения, чем при обычной микроскопии. Возможность выявления микобактерий туберкулеза увеличивается на 10-15% по сравнению с обычной бактериоскопии и на 8% - по сравнению с методом флотации.

Используют люминесцентный микроскоп под малым увеличением. На темном фоне видны золотисто-желтые микобактерии туберкулеза.

Фазово-контрастная микроскопия

Это единственный микроскопический метод исследования, позволяющий наблюдать микобактерии и их биологически измененные формы в живом состоянии. Для проведения такого исследования применяют специальное фазовоконтрастное устройство.

При цитологическом исследовании мокроты у больных туберкулезом легких оказывается незначительное количество нейтрофилов в стадии значительной дегенерации на фоне казеозного детрита, скопления мононуклеаров, гигантских клеток Пирогова-Лангханса, иногда эозинофилы.

В случаях, когда мокроты нет или она выделяется в очень малом количестве, больному назначают отхаркивающее микстуру или раздражающие ингаляции. Кроме того, в случаях, когда нет мокроты, исследуют смыв из бронхов.

Исследование смыва из бронхов

Оно проводится врачом. Для этого больному натощак смазывают корень языка, заднюю стенку глотки и надгортанник 1% раствором дикаина. Затем гортанным шприцем вливают в трахею 5-10 мл изотонического раствора натрия хлорида. У больного сразу возникает сильный кашель и введен изотонический раствор натрия хлорида выкашливается на чашку Петри. Также смыв из бронхов (БАС — бронхоальвеолярный смыв) получают с помощью БАЛ — бронхо-альвеолярного лаважа, который проводят при бронхоскопии. БАЗ исследуют методом флотации или методом посева. Исследование смыва из бронхов позволяет дополнительно выявлять МБТ в 5-10% случаев.

Исследование мочи, кала, цереброспинальной и плевральной жидкости на МБТ

В клинической практике МБТ нередко приходится проявлять в моче, кале, цереброспинальной и плевральной жидкости. Исследование мочи на МБТ проводят в тех случаях, когда в ходе исследования осадка в каждом поле зрения оказывается не менее 15 лейкоцитов.

Для выявления МБТ мочу многократно центрифугируют, наслаивая каждый раз новые порции с осадка мочи на предметное стекло. Мазок окрашивают по методу Диля-Нильсена. Выявление микобактерий туберкулеза в моче свидетельствует о наличии туберкулеза почек.

Для исследования мочи по методу флотации дают ей постоять, затем 20-30 мл осадка обрабатывают, как обычно, без подогрева на водяной бане. Отсутствие МБТ в гнойной мочи и это не исключает наличия туберкулеза почек. В таких случаях нужно или делать ее посев на питательные среды, или применять биологический метод исследования.

Исследование кала на МБТ следует проводить в случаях подозрения на туберкулез кишок. При этом надо помнить, что у больных, выделяющих МБТ и частично заглатывают мокроту, МБТ можно выявить при исследовании кала и за непораженных кишок, поскольку микобактерии туберкулеза устойчивы и не всегда погибают под воздействием пищеварительных соков. В кале больных туберкулезом кишок часто оказывается слизь, кровь и примеси гноя.

Обнаружение МБТ в цереброспинальной жидкости нередко имеет решающее значение в диагностике туберкулезного менингита. Однако бактериоскопическим методом выявить МБТ удается только в 10-20% больных туберкулезный менингит. Исследование проводится по следующей методике. Пробирку с цереброспинальной жидкостью ставят на 8-10 часов в прохладном месте. Если в ней образуется нежная фибринная пленка (она состоит из клеток и МБТ), ее наносят на предметное стекло и готовят препарат по методу Циля-Нильсена. В случаях, когда пленка не образуется, препарат готовят из осадка после центрифугирования.

Для выявления МБТ в плевральном экссудате, пунктатах и выделении из свищей готовят препарат так же, как и при исследовании мокроты.

Бактериологическое исследование состоит из посева материала на питательные среды и дифференциации культуры МБТ от кислотоустойчивых сапрофитов. Этим методом можно обнаружить микобактерии туберкулеза, когда в 1 мл материала находится 20-100 микробных клеток. Пробирки со средой помещают в термостат при температуре 37 ° С. Первые колонии микобактерий могут появиться на 18-30-й день, а иногда — через 2-3 месяца. Бактериологическое исследование проводят одновременно с бактериоскопическим трижды.

Посев исследуемого материала производится на специальные среды после предварительной обработки. Чаще всего используют такие среды: Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Миддлбрука, Огава и др., которые содержат вещества, задерживающие рост посторонних микроорганизмов. Предварительная обработка патологического материала заключается в уничтожении сопроводительной бактериальной флоры. Посев материала из бронхов, а также посев мочи делают из центрифугата или осадка. При этом мочу, если она не загрязнена, можно не обрабатывать.

Предварительная обработка биологического материала

Для подготовки к посеву мокроты, плеврального экссудата, цереброспинальной жидкости существует несколько методов предварительной обработки.

Метод Мазура заключается в обработке патологического материала 3-4 мл 2% раствором серной кислоты в стерильной пробирке. Пробирку встряхивают в течение 3 мин., после чего материал стерильной платиновой петлей наносят на яичные среды.

Метод Петрова: мокроты обрабатывается 4% раствором гидроксида натрия в течение 15 мин., А затем центрифугируется.

Биологический метод

Это привитие патологического материала животным. Гвинейским свинкам или белым мышам в паховой участок или в брюшную полость вводят исследуемый материал в дозе 2-3 мл. Для этого его сначала обрабатывают 3 8% раствором соляной кислоты, хорошо отмывают (иначе на месте введения может возникнуть некроз тканей, возможна даже смерть животного от воздействия кислоты).

Незагрязненную мочу и СМЖ можно прививать без предварительной обработки. При наличии в патологическом материале вирулентных штаммов МБТ ​​животного заболевают туберкулезом и погибают через 1-2 месяца после заражения. Если МБТ масс ослабленную вирулентность, животное погибает позже или может совсем не погибнуть. В таких случаях животное забивают, и диагноз устанавливают после вскрытия, макро- и микроскопического выявления туберкулезных бугорков. Диагноз можно поставить на основании прижизненного исследования увеличенного регионариого лимфатического узла или инфильтрата, возникший на месте инокуляции патологического материала.

В последние годы для дифференциации микобактерий используют метод газожидкостной хроматографии, основанный на высокой способности различных соединений (аминокислот, нуклеиновых кислот, жиров, углеводов и т. д.). При этом не исключается этап культивирования возбудителя на питательных средах, что можно отнести к недостаткам метода.

Ускоренные методы поиска микобактерий

К ускоренным методам обнаружения микобактерий принадлежат выявления МБТ с помощью индикаторной пробирки ВВL МОИТ. Рост микобактерий туберкулеза происходит в течение 4-10 суток. Пробирки ВВL МОИТ содержат бульон и флуоресцентное соединение, реагирует на кислород, растворенный в бульоне. Исходная концентрация кислорода не дает яркого свечения. При поглощении кислорода культурой МБТ наблюдается яркая флуоресценция на дне пробирки. Такой результат считают положительным. Если флуоресценции нет или она незначительна — результат отрицательный. Показания пробирок учитывают ежедневно, начиная со второго дня инкубации.

В последнее время для диагностики туберкулеза используют иммуноферментные и молекулярно-генетические методы.

Молекулярно-генетические методы

Появились методы идентификации МБТ с помощью моноклональных антител, полученных способом гибридомной технологии. Сейчас существует более 100 моноклональных антител к эпитопам основных антигенов МБТ. Применение этих антител в иммуноферментном анализе дает возможность очень быстро дифференцировать вид возбудителя, но пока метол используется в научных разработках для идентификации возбудителя туберкулеза, который чаще всего встречается.

Среди молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза чаще всего применяется метод ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе этих методов лежит принцип комплементарности нуклеотидных оснований в построении двуспиральной молекулы ДНК. При проведении ДНК-зондирования в случае наличия в пробе исследуемого специфического участка ДНК микобактерий образуется гибрид (двухцепной фрагмент) ДНК исследуемого и ДНК-зонда.

В основе приципа ПЦР лежит многократное увеличение фрагмента ДНК. Для амплификации (многократного удвоения гена бактерий) требуется наличие двух праймеров (затравок) — небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, что соединяется с комплементарной участком одной из цепей матричной ДНК. В дальнейшем происходит достройка этой цепи ДНК-полимеразой. Увеличение количества (в 106 раз) фрагмента амплифицируемого оказывается электрофорезом в агаровом геле. Учет результатов реакций осуществляется под пластинами трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете,

ДНК-зондирование позволяет проводить определение микобактерий в диагностическом материале в течение 2-4 суток, а ПЦР — за 4-6 ч. с максимально высокой чувствительностью методов — 10-100-1000 клеток в пробе исследуемого.